中药中黄曲霉毒素的研究进展＊

张晓萍，刘笑笑，苗 菊

（1.兰州市食品药品检验所，甘肃 兰州 730050；2.甘肃省种植中药材外源性污染物监测工程研究中心，甘肃 兰州 730050；3.甘肃医学院，甘肃 平凉 744000）

中医药体现了中华民族的博大智慧，随着我国中医药事业的不断发展，中药材的需求和使用量日益攀升，同时中药的安全性问题也受到国内外的广泛关注，其中真菌毒素残留引起中药材及其制品质量发生变化是主要因素之一。研究表明，黄曲霉毒素具有很强的毒性和致癌性，中药材在其种植、采收、运输和贮藏过程中，每个环节都可能因为操作方法不当而被黄曲霉毒素污染，从而导致大量黄曲霉毒素的生长和积累，这将直接影响中药的质量与疗效，极大地危害着人们的身体健康，并且使中药的质量与使用安全得到了限制。目前，对于食品中黄曲霉毒素的相关研究较多，并且在防控措施、限量标准等方面都做了规定，但对中药中黄曲霉毒素污染的系统研究尚不够深入。因此，关注中药材、中药饮片及其制剂中黄曲霉毒素的污染状况，对中药的安全性保证有着不容忽视的意义。对黄曲霉毒素的危害及中药中黄曲霉毒素的分析技术的研究进展进行综述，并进行相关的展望，以期为黄曲霉毒素的准确测定提供参考。

1 黄曲霉毒素概况

黄曲霉毒素（Aflatoxin，AFT）是由黄曲霉素（Aspergillus flavus）和寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)等菌株产生的双呋喃环毒素，是一类真菌毒素[1]，迄今为止已发现其代谢产物有20 余种，分别命名为A1、B2、B2a、B3、G1、G2、G2a、M1、M2、M2a、Re、P1、Q1、毒醇H 等[2]，其基本结构是一个氧杂萘邻酮和一个双氢呋喃环，前者通常被认为与致癌作用有关，后者是毒性结构，其代谢产物在分子结构上十分接近，目前化学结构已明确的有12 种[3]，目前研究较多的是B 族，G 族，M 族的B1，B2，G1，G2，M1，M2，其化学分子式分别为C17H12O6、C17H14O6、C17H12O7、C17H14O7、C17H12O7、C17H2O7，其中以黄曲霉毒素B1的毒性最为剧烈，其毒性约是氰化钾的10 倍，砒霜的68 倍，肝毒性和致癌性也最强，极毒量为1000μg/kg，可致人死亡[4]；1993 年，世界卫生组织的癌症研究机构把AF 划定为一类致癌物，属于剧毒物质[5]。《中华人民共和国药典》2015 年版规定了陈皮、莲子、桃仁、僵蚕、大枣、地龙等19 味药材的黄曲霉毒素限量，限度为黄曲霉毒素B1不得超过5μg/kg，黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的总量不得超过10μg/kg，规定的净化方式为免疫亲和柱净化，高效液相色谱或液相色谱-质谱联用法检测。

2 中药中黄曲霉毒素前处理分析技术

前处理是对样品进行分析的主要步骤，此过程所需的时间较长，一个正确的前处理方法直接影响着检测结果的准确性和灵敏度，同样，此过程也容易对测量结果造成误差。由于中药样品基质的复杂性,以及其所含黄曲霉毒素含量高低的影响,在仪器分析前采取适当的样品前处理技术对目标物进行提取、净化是很有必要的[6]。

2.1 提取方法

进行一次效果较好提取的前提是，提取充分且所提取物质中含有的非目标组分尽量少，这将有利于进行后续的分离和纯化。黄曲霉毒素寄生在中药基质的各个角落，需要不同提取方法进行提取。目前常用的提取方法主要有振摇提取法、超声提取法、高速均质提取法等［7］。

振摇提取法是一种最基本的提取方法，其优点是样本稀释后会大幅度增加液体的流动性，从而使提取效率得到提高，且使样本不被破坏，但对于不同基质的中药黄曲霉毒素，其提取率差别较大。杨小丽等［8］测定动物类药材中的黄曲霉毒素，样品提取采用振摇提取法，在水平摇床上振摇提取40 分钟，免疫亲和柱净化后用HPLC-FID 测定，结果黄曲霉毒素的平均回收率为78.8%～106.7%。

高速均质提取法是借助于均质机器，将样品与提取溶剂混合后高速旋转，使两者充分接触，从而将中药中的黄曲霉毒素提取出来。但是高速搅拌可能会破坏提取物的分子结构。

超声提取法是利用超声波的一系列作用与效应使细胞内有效物质快速释放、扩散和溶解，以此来提高提取效率，但由于此法破碎力较强，所以杂质也较多。周颖等[9]用固相萃取-液相色谱-质谱法测定益母草中的7 种真菌毒素，对比考察了超声和均质两种提取方式，结果表明，超声和均质提取的回收率基本相当。

2.2 净化方法

净化样品是黄曲霉毒素分析中的重要步骤，净化是指在检测前，为了提高检测结果的灵敏度，在不损失或尽量少的损失待测黄曲霉毒素的前提下，去除干扰杂质，如蛋白质、脂肪、色素等的过程。由于中药基质的不同，以及所含毒素微量的原因，样品的净化也是测定黄曲霉毒素的难点所在。目前常用的净化方法主要为免疫亲和柱净化法、固相萃取柱净化法及QuEChERS 法等。

免疫亲和层析(Immune Affinity Column，IAC)法的原理是抗原抗体反应，免疫亲和柱内连接着抗体，样本中经过提取的黄曲霉毒素，在通过含有AFT特异抗体的免疫亲和柱时，黄曲霉毒素交联在层析递质中的抗体上[10]。这种净化方法操作简便，特异性和选择性强，且回收率高，但价格昂贵。《中华人民共和国药典》2015 版四部黄曲霉测定法规定黄曲霉毒素的净化采用此方法［11］。张玉莲等[12]选用免疫亲和柱净化，HPLC-FLD 法测定天麻药材中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的含量。结果表明，该检测方法线性关系良好(r＞0.9985)，回收率在87%～108%之间。B1、B2、G1、G2的精密度分别为1.3%、0.9%、3.5%、2.9%,检出限分别为0.23μg/kg、0.15μg/kg、0.44μg/kg、0.30μg/kg。

固相萃取柱 (SPE，Solid Phase Extraction)净化法的原理是选择性吸附与选择性洗脱的液相色谱法。惯用的方法是使待测样品溶液通过固相萃取小柱，先使被测组分被吸附，然后再使用适宜强度的溶剂冲洗，除去其余杂质，最后用少量溶剂洗脱被测组分；也可以让被测物流出而选择性的吸附干扰杂质，或将两者同时被吸附，再使用合适的溶剂选择性洗脱被测物质。但此法的缺点是专一性差，不能充分净化痕量黄曲霉毒素。Han 等[13]用0.9g 的氧化铝和1.6g 的硅胶为填料，自制一种多功能净化柱，用于中药中6 种黄曲霉毒素的净化，采用HPLC-MS 测定，结果6 种黄曲霉毒素的平均回收率为85.6%～117.6%，相对平均偏差为1.3%～16.1%。

QuEChERS(Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe) 法原理与固相萃取 (Solid Phase Extraction，SPE)、高效液相色谱法 (High Performance Liquid Chromatography，HPLC)原理相似，都是利用吸附剂吸附杂质的原理，从而达到净化的目的，主要用于痕量组分的分析。QuEChERS 方法操作简单，分析速度快，精确度和准确度高，溶剂使用量少且乙腈加入后密闭，对操作人员的安全性高，污染小，但去除杂质的效果较差是其缺点。操作步骤可以简单的归纳为:①样品粉碎；②加入乙腈提取、分离；③加入硫酸镁等盐类除水；④加入乙二胺-N-丙基硅烷等吸附剂去除杂质；⑤上清液进行气相色谱-质谱联用仪、液相色谱-质谱联用仪检测。李春等[14]将何首乌粉碎后的药粉中加入水、经验证的提取效果最好的含1%乙酸的乙腈溶液涡旋，再加入4 种固体试剂，超声处理，检测4 种AF 类毒素，同时验证了此法为集提取、净化为一体的方法，在很大程度上节省了检测时间。

3 黄曲霉毒素的检测技术

黄曲霉毒素的检测从最开始的以薄层色谱扫描法（TLC）为主，发展到了用高效液相色谱法（HPLC）来检测，再到免疫学方法等，这些进展都和新仪器、新的化学检测技术的应用密不可分。这些新的检测分析方法的快速应用，使得黄曲霉毒素的测定有了更多的选择机会，也为不同检测目的提供了更多适宜的检测方法。目前采用的方法主要有薄层色谱法、高效液相色谱法、高效液相色谱-质谱联用法。

3.1 薄层色谱法

薄层色谱法是用来测定黄曲霉毒素的经典方法之一，在1990 年时被收录在AOAC 标准中，这种检测方法的原理是利用黄曲霉毒素或其代谢产物在固定相和流动相中的有很大的分配系数的差异，将待测样品通过提取、过柱、层析、洗脱、浓缩、薄层等一系列的方法进行分离，然后在365nm 的紫外波长下，使黄曲霉毒素产生特定颜色的荧光，最后将检测出来的荧光与标准品的荧光进行比较，从而测定黄曲霉毒素的量，不同的衍生物分别显示不同的荧光[15]。TLC 法所需设备简单，费用低，但由于其提取物易含较多杂质且前处理繁琐，特异性和灵敏度较差，且测定黄曲霉毒素专一性不够，已经越来越不适合当前时代分析的要求了[16]，目前多用于黄曲霉毒素化学分析法的一般佐证。

3.2 高效液相色谱法（HPLC）及高效液相色谱-质谱联用技术（HPLC—MS）

高效液相色谱法（HPLC）的检测原理是基于高效液相色谱仪加柱后衍生系统进行分离，然后用荧光检测器（FLD）进行检测。HPLC 检测，在确保准确度的前提下，还具有快捷、稳定和灵敏的优点，是目前常用来检测黄曲霉素的方法之一[17]。基于对B1，G1 灵敏度不高，所以采用反相液相色谱法（RPLC）来测定。RPLC 系统易操作，流动相毒性低，且不易受沸点，热稳定性和分子量等的限制，可同时分析样品中不同的黄曲霉素衍生物，如B1、B2、G1、G2、M1，近几年内得到了广泛的应用[18]。但是其柱前柱后衍生分析时间长，易出现假阳性。对于柱前的衍生，可用免疫亲和柱和HPLC 联用，比单用的效果更佳，柱后的衍生可用LC—MS。

LC—MS 是最近几十年来发展起来的检测技术，是一种集高效分离与多组分定性、定量于一体的联用检测技术，这种联用检测技术在HPLC 原有快速、灵敏、准确的基础上，很大的提高了检测的灵敏性及检测结果的特异性。由于其能够精确检测黄曲霉素含量的特点，是目前为止最权威的检测技术[19]。这种技术的发展使得对复杂物质的成分分离与检测向着高效率和高可靠性的方向发展。李洪波[20]等采用了高效液相色谱联用质谱法来测定玉米中的AFB1，其测定结果显示，黄曲霉素在不同种的玉米样品中的检测限为0.5μg/kg，在0.2～5.0ng/ml 范围内线性关系良好。虽然此种方法有着显著的优势，但因为其设备操作复杂，对操作人员要求高，且仪器价格昂贵，这成为一直以来阻碍此种检测方法普遍使用的原因。

3.3 免疫学方法

免疫学方法是目前比较有效的用来检测黄曲霉毒素的方法，其检测方法的种类分类很多，以下介绍几种经常用来检测黄曲霉毒素的方法，包括金标免疫层析法（GICA）、酶联免疫法（ELISA）、微柱筛选法。

酶联免疫吸附法（ELISA）是于20 世纪70 年代新开发出来的用于检测病毒的免疫检测技术,是由瑞典学者ENGVALL 和PERLMAN，荷兰学者VAN WEEMAN 几个人最早同时提出的[21]。在这种方法的使用初期，主要用来检测病毒,到了70 年代中后期的时候才逐渐应用到了真菌毒素的检测方面[22]。ELISA 的检测原理是，抗原或抗体吸附剂与用酶标记的抗体或抗原和标本中的待测物发生特异的免疫学反应，然后用测定酶活力的方法来增加此种检测方法的敏感度[23]。常用双抗体夹心和竞争法来测定黄曲霉素的含量[24]。其优点是检测速度快，强特异性，提取步骤简便，成本较低，特别适用于监测黄曲霉毒素污染的大量样品的筛查。但由于酶本身具有的性质，其活性易受各种反应条件的影响，从而导致其测定结果的重复性不好，容易有假阳性的问题，因此在测定时要对反应条件做一些特殊处理。

免疫层析法是于20 世纪80 年代初出现的用于快速检测的免疫技术，该法操作简单、方便、快捷，不需任何特殊的仪器设备，非常适合大量样品的初筛和现场测试。金标免疫层析法则是将色谱层析技术和胶体金免疫技术同时结合，利用待检样品中的黄曲霉毒素代谢物B1 与胶体金表面的抗黄曲霉毒素B1 单克隆抗体发生抗原抗体反应，以此来对黄曲霉毒素进行检测[25，26]。这种检测方法能在短时间内就可以检测出被测物中黄曲霉毒素的浓度，并可以直接读取其结果。可以一步检测是这种方法最大的优点，检测方便且效率高。

微柱法检测黄曲霉素是基于微柱管内的吸附剂（硅镁型）可以吸附黄曲霉毒素，并且其在紫外(UV)365nm 的下显示特定颜色的荧光，在一定的浓度范围内，黄曲霉毒素的含量与测定的荧光强度成正比关系，以此来粗略测定黄曲霉毒素含量[27]。肖志军等人[28]对亲和柱进行了研究，结果表明使用不同的微柱，加标回收率在80.0%～91.5%之间，不同批次加标回收率无显著差异。但选用微柱筛选法来测定黄曲霉毒素的含量时，只能测定，其总量，而不能分离测定几种代谢物的量。

3.4 其他方法

除了上述所述的几类检测方法外，仍有许多方法用于黄曲霉毒素的检测。如超光谱法（HS），超光谱法的原理是，先通过特定的光源激发需要检测样品，然后通过仪器捕捉使之成像，再对最后所成像进行抽取，并依据特征排列，以此来实现对黄曲霉毒素污染的样品和未被黄曲霉毒素污染的样品的区分[29]。超光谱法具备准确、快速、无损待测物的特点，此检测方法对于我们发展更优的检测技术是至关重要的。

4 总结与展望

黄曲霉毒素的高毒性、高致癌性，以及难以通过高温除去的特性，决定其对人类的健康造成严重的危害，随着人们对黄曲霉毒素认识水平的提高，消费者对药品安全意识的增加，黄曲霉毒素及一些相关的菌株所引起的安全问题必将越来越受到人们的关注与重视。因此，发展和建立一些安全、快速、有效、经济的检测方法变得尤为重要。我国用来检测黄曲霉毒素的高效液相色谱法(HPLC)，检测限值低且检测结果准确，但由于在检测过程中需要用到一些对人体有毒有害作用的试剂，会对检测人员的身体造成危害。薄层色谱法(TLC)作为传统的检测方法之一，与液相色谱法一样，会对检测的人员健康造成危害。因此，未来检测技术的发展方向应该同时具备检测结果的准确和安全两大特性。

随着黄曲霉毒素特异性抗体的研制成功，使得高质量抗体获得容易，从而使利用抗原抗体反应而设计的免疫传感器得到快速的发展和广泛的应用，它具有操作简单、检测速度快、灵敏度高、成本低廉等优点，这将非常适合天然食品现场的快速定量、定性检测。目前，还有将发展迅猛的生物技术和免疫学技术结合起来的检测方法，必定极大地的影响黄曲霉毒素和各种致病微生物的测定，这都将在近几年的研究中越来越得到重视，同时也会成为黄曲霉毒素检测技术未来发展的趋势[30]。此外，随着纳米技术的发展，表面增强拉曼散射(SERS)技术被普遍的应用于微量物质的检测，以表面增强拉曼散射技术为基础的黄曲霉毒素检测方法，具有结果准确、检测快速、样品需要数量少的优点，适用于痕量物质的分析检测，是今后黄曲霉素检测分析技术发展的趋势所在[31]，所以有希望在未来的某一天发展一个受约束小且高效的黄曲霉毒素检测技术。