脑红蛋白与肿瘤的研究进展＊

赵 晶，李彦荣

（1.定西市人民医院检验科，甘肃 定西 743000；2.甘肃中医药大学定西分校，甘肃 定西 743000）

1 Ngb 的基本特征

Ngb 在体内主要以单体形式存在，也有部分多聚体形式。单体的Ngb 与Mgb 非常相近，含有151个氨基酸的单链，相对分子量为17000；但与Mgb 和Hgb 五配体结构不同，Ngb 主要以脱氧亚铁的六配体形式存在[1]。尽管Ngb 与Mgb、Hgb 的氨基酸序列同源性很低（＜25%），但具有功能特征的氨基酸折叠结构都是一致。频谱测定重组发现六配位Ngb 的结合形式为His-Fe2+-His，氧和一氧化碳可以替换内源性蛋白配体与Ngb 结合。Ngb 与氧和一氧化碳有较高的结合率和较低的解离率，半饱和氧分压约为P50=0.266 kPa，高于肌红蛋白的（P50=0.133 kPa）而低于血红蛋白（P50=3.458 kPa）[2]。所以，Ngb 更有利于组织在血氧浓度很低时增加对氧的摄取能力。但同时Ngb 又容易自我氧化，Fe2+转变成Fe3+，导致结合氧的能力受限。

作为一种携氧球蛋白，Ngb 主要分布于耗氧量高的神经系统及内分泌系统。仅有体重2%的大脑耗氧量占到全身的20%以上，Ngb mRNA 广泛地表达于脑组织中，Ngb 蛋白在脑组织中的浓度为1 μmol/L，占全脑组织总蛋白含量的0.01%，主要分布在大脑皮质、海马、丘脑、下丘脑、嗅球和小脑；视网膜是人体中耗氧量最大的神经组织，Ngb 蛋白浓度更是达100μmol/L，占全视网膜总蛋白量的2%～4%，Ngb mRNA 表达在视网膜三级神经元（感光细胞内节段、外核层、内核层、节细胞层），而Ngb 蛋白分布于视网膜色素上皮层、感光细胞内节段、外丛状层、外核层、内丛状层、内核层、节细胞层，内外丛状层是耗氧量高的突触连接区域[3]，提示Ngb 参与了视觉形成和传递中的高耗氧程序。另外，报道在正常的脑垂体、胰腺、肾上腺和睾丸组织中有低水平的Ngb 存在，但在肝、心、横纹肌、肺、小肠、肾和血管中均未发现[4]。

Ngb 虽然与组织耗氧尤其是神经组织耗氧密切相关，但它的具体功能一直处于争论和研究之中。亚细胞定位Ngb 多集中于线粒体周围，说明Ngb 很可能促进氧向神经元线粒体的扩散，或直接介导氧向神经元线粒体的传递，供给线粒体产能，从而满足神经细胞活跃的需氧代谢需求。但是，Ngb 蛋白在正常脑组织中的浓度太低难以发挥像Mgb（肌肉中肌红蛋白的含量为100～400μmol/L）一样的储氧、供氧作用[5]，即使视网膜中浓度较高，但从Mgb 分离氧也同样困难。因此，像Mgb 和Hgb 那样给正常组织供氧不太可能是Ngb 的主要功能。

2 Ngb 在肿瘤中的表达

虽然大多数研究表明Ngb 在正常组织中存在于神经元而非神经胶质，但Chen 等报道从新生老鼠大脑中分离培养的星形胶质细胞中检测到Ngb mRNA 和蛋白质，并且Ngb 和GFAP 双抗免疫染色呈阳性表达[6]；在脑外伤、脑型疟和自身免疫性脑病的小鼠模型中也发现Ngb 表达在神经元以外的反应性增生的胶质细胞。这些结果表明，在某些病理条件下Ngb 可以出现在神经胶质标记阳性的细胞。神经胶质瘤是最常见的主要影响人类中枢神经系统的肿瘤，所有神经胶质瘤中星型胶质细胞瘤发生的发病率在80%～85%。Qin 等通过逆转录-聚合酶链反应和免疫荧光法发现Ngb 存在于大鼠星形细胞瘤细胞系(C6)、人星形细胞瘤细胞系(U251)，免疫印迹显示目标分子量与Ngb 相同，并使用免疫组化方法在人星形细胞胶质瘤标本中检测到Ngb 表达[7]。GBM 是成人最主要的恶性脑组织肿瘤，Emara 等在7 种人类GBM 细胞系中发现了Ngb mRNA 和蛋白。GBM虽然被列为神经胶质肿瘤，但其细胞起源尚不清楚，GBM 细胞可以共同表达神经元和胶质的标记[8]，并且有证据表明神经干细胞恶性分化可能发展为GBM 肿瘤[9]，因此，原本存在于神经元的Ngb 出现在GBM 细胞也似乎不意外了。

研究发现Ngb 开始出现于神经干细胞分化时期[10]，神经干细胞与肿瘤干细胞有诸多相似的特征。Fordel 等使用RT-PCR 和免疫组化技术在神经母细胞瘤SH-SY5Y 细胞株中发现Ngb mRNA 和Ngb 蛋白[11]。这些研究结果提示与神经发育有关的肿瘤都有可能表达Ngb。

Emara 等进一步研究发现在所有人类脑部肿瘤都检测到Ngb[12]，包括I-IV 级星型细胞瘤和室管膜细胞瘤、节细胞胶质瘤和少突神经胶质瘤。并且在肿瘤切片显示了Ngb 的三种染色模式：（1）均匀一致的表达在整个实性组织；（2）细胞染色阳性区域在阴性或弱染色组织中间；（3）染色浓密的核心区域是强阳性的焦点所在。在个体肿瘤切片中，Ngb 的表达水平通常是肿瘤中比其匹配正常组织中有所增加。

Urszula 发现在非小细胞肺癌(NSCLC) 中Ngb mRNA 呈阳性表达，而且肿瘤组织比邻近的正常肺组织中的表达要显著的多[13]，这与Emara 研究结果一致；实验进一步通过细胞株panel 分析，发现Ngb表达水平最高的是两个有神经内分泌表型的SCLC细胞系；但是在上皮组织和其相应的恶性组织中没有检测到Ngb mRNA 表达。而不同的情况出现在人肝癌样本中，与相邻的非肿瘤组织和正常肝组织相比，肿瘤组织的Ngb mRNA 和蛋白表达明显降低。造成这一矛盾结果的原因可能是样本太少、试验方法未标准化，也可能是Ngb 在不同类型的肿瘤中发挥的作用并不一致。

3 Ngb 在肿瘤中的功能

3.1 氧载体功能

因为Ngb 保留了Hb 和Mb 球蛋白折叠的所有特征（虽然氨基酸序列与Hb 或Mb 相似性极小），显示出很高的氧和一氧化氮的亲和力，所以猜测它具有氧载体功能，可能作为类似Mb 存储氧运输氧，从而促进氧分子扩散到线粒体。在胞瘤组织中，新生微血管的数量往往难以满足生长快速而混乱的肿瘤细胞的耗氧量，所以缺氧微环境是人类肿瘤的一个基本特征，因此适应低氧状况是肿瘤发生发展的一个至关重要的步骤。根据Ngb 的结构特点推测，能够结合氧的Ngb 在肿瘤组织中可能通过存储氧或运输氧来维持肿瘤细胞的迫切需要。在研究的大多数肿瘤组织中发现Ngb 上调是其有力证据。但在正常组织中，由于血供充足而Ngb 浓度低、氧亲和力比Mb 低使其储氧携氧的功能对于机体并不重要。

3.2 ROS 清道夫功能

SUN 第一次证明了Ngb 的神经保护作用，通过抑制Ngb 表达可以减少缺氧条件下培养的神经细胞数量，而Ngb 超表达可以促进该类细胞的生存。在神经母细胞瘤的实验中，当Ngb 蛋白质表达增加或降低，过氧化氢水平被发现相应更低或更高；更多的实验证实在缺氧或合并低糖时Ngb 表达上调，显示对神经细胞或肿瘤细胞的保护作用；基于Ngb的分布特征——集中于耗氧量高的神经区域（脑和眼）和细胞中靠近线粒体而自身储氧携氧能力有限的情况分析，Ngb 可能在病理组织清除活性氧或氨基产物中发挥了重要作用；关于遗传铁蛋白病变的研究支持了这个功能假定，Ngb 作为一个积极的游离基清除剂，在Fe-NO 形式中Ngb 超过Hb 更快与过氧化硝酸盐反应[14]，并且与Hb 和Mb 不同，与过氧硝酸盐和过氧化氢的反应没有产生细胞毒性产物，有利于细胞生存。

3.3 信号感受器功能

Ngb 天生具有结合氧的装置，可以作为一个组织细胞的氧感受器发挥作用。Ngb 的结合端不仅可以连接氧也可以连接信号蛋白，比如异源三聚体G蛋白的亚基、14-3-3 蛋白、细胞色素C[15]。Ngb 与这些蛋白的反应会受缺氧条件的控制，但其中机理尚不清楚。在肿瘤细胞中Ngb 可能出现上调或下调，上调意味着Ngb 启动了缺氧反应机制，下调可能是由于启动子甲基化抑制了Ngb 的表达[16]。尽管人Ngb 上游因子缺少HIF-1 等缺氧因子的接口，但Ngb 启动子区域包含AP-1 和NFkB 结合接口，它们的基因表达与HIF-1 的表达相关，并且两者都已报道在缺氧时被激活；而在30.8%的非小细胞肺癌病例中Ngb 启动子被甲基化造成Ngb 下调，通过5-氮脱氧胞嘧啶和/或曲古抑霉素A 对肺癌细胞的影响证实了这种调节机制的存在。尽管在肿瘤组织中同时出现高频的mRNA 表达和启动子甲基化似乎是矛盾的，目前也不清楚Ngb 启动子甲基化是肿瘤进展的步骤还是仅仅一个附带的突变，但这足以说明Ngb 在肿瘤发生发展中作为一种连接氧或其他信号并且可以在细胞内级联放大信号的传递者。

可能具有肿瘤抑制因子功能。在体外和体内的人类肝癌细胞系(HepG2)实验中[17]，强表达的Ngb 抑制Raf/MEK/Erk 活性，反之敲出Ngb 后Raf/MEK/Erk 活性增强，药物性抑制Erk 活性则可以中止敲出Ngb 后HepG2 细胞的增殖反应，而Ngb 的氧结合部件(H64L)突变则中止了Ngb 对Erk 活性的抑制作用。因此，认为Ngb 通过链接氧/ROS 信号与致瘤Raf/ MAPK/ Erk 信号途径而控制肝癌发展。在其他肿瘤中是否也存在类似功能有待进一步研究。

目前，Ngb 的功能尚不完全清楚。作为一种携氧蛋白，尤其是其在神经组织、肿瘤组织以及在缺氧等相关病理状态下的特殊表达，说明Ngb 的存在十分重要。研究发现Ngb 在特定的组织和细胞内功能是不同的，在恶性肿瘤，由于慢性缺氧或氧化应激反应，组织和细胞的新陈代谢以及关键信号的转导通路已经从根本上发生改变，Ngb 在肿瘤细胞中可能发挥了比正常组织中更重要更复杂的作用。