南瓜实蝇气味结合蛋白和4种小分子配体的分子对接

汪斌伟，柯 莎，李 珣，袁盛勇，孔 琼，王传铭，张晓媛，李秀芳，杨华芳

（红河学院/云南省高校滇南特色生物资源研究与利用重点实验室，云南蒙自 661199）

气味结合蛋白（Odorant binding proteins，OBPs）是一种存在于昆虫化学感受器官的水溶性酸性蛋白，是气味分子和受体间的桥梁，在信息素识别、嗅觉信号传导及运输等具有重要作用，从而影响着昆虫取食（雌雄虫的趋性行为）、繁殖（配偶探求、交配和产卵）和天敌躲避等生理行为反应。[1-3]由于OBPs对气味分子选择具有相对专一性，且每一种OBP只能结合某一类别的气味分子，是昆虫嗅觉识别过程中的关键步骤。[4]而分子对接是研究小分子配体与大分子受体间相互作用的一种方法，可预测二者间的亲和力、结合模式和结合情况，从而筛选出与大分子受体结合能力较强的小分子配体。[5]该技术已被应用于多个领域，如生物大分子的修饰、药物设计、昆虫嗅觉机制等方面。[6-8]

南瓜实蝇Bactrocera tau(Walker)是一种重要的检疫性害虫，分布于我国的东南沿海、华中、华南、西南等地区，其寄主广泛，危害严重。[9]目前该害虫防治仍靠化学方法，且根据昆虫寄主挥发物筛选出的干扰剂在害虫防治上也得到了广泛应用。本文通过同源建模预测南瓜实蝇OBPs的三维结构，运用分子对接技术对南瓜实蝇OBP2、OBP8、OBP9的三维结构与4种小分子配体（十七烷、十八烯、D-香茅醇、D-柠檬烯）之间的相互作用和结合能力进行分析，为了解南瓜实蝇OBPs与挥发性气味分子之间的作用机制，并筛选出结合力较强的挥发物，为南瓜实蝇的田间防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

利用本课题组的前期研究结果克隆鉴定出的南瓜实蝇气味结合蛋白基因OBP2、OBP8、OBP9的序列（GenBank登录号分别为：KT716322.1、KT716317.1、KT716318.1）和4种小分子配体（十七烷、十八烯、D-香茅醇、D-柠檬烯）的三维模型为试验材料；同源建模采用SWISS-MODEL在线服务程序构建，ChemBio3D软件进行优化；分子对接采用SYBYL软件等。

1.2 方法

1.2.1 南瓜实蝇OBPs三维模型构建及配体分子三维结构的优化

通过ExPASy平台中的SWISS-MODEL程序在线搜索与南瓜实蝇OBP2、OBP8、OBP9相似度较高的模板，将南瓜实蝇OBPs序列与模板蛋白序列比对，选择同源性较高的模板进行三维建模，再对其三维模型进行去除H2O、加H和添加缺失原子等优化处理。[10]同时通过Pubchem在线数据下载十七烷、十八烯、D-香茅醇和D-柠檬烯这4种挥发性物质的三维结构，并运用ChemBio3D对十七烷、十八烯、D-香茅醇、D-柠檬烯进行立体空间结构构建和最小能量优化。[11]

1.2.2 分子对接

本文采用柔性方式进行分子对接，即用SYBYL软件对南瓜实蝇OBP2、OBP8、OBP9和十七烷、十八烯、D-香茅醇、D-柠檬烯分别进行空间结构对接，通过Surflex-docking模块，使用原型分子(protomol) 为结合口袋，根据参数Threshold值和Bloat值确定其结合口袋形状及大小，找到南瓜实蝇OBPs与配体分子的最优构想和结合模式进行对接，得到打分函数。[12]

2 结果与分析

2.1 同源建模

2.1.1 南瓜实蝇3个OBP的三维模型

基于氨基酸序列和结构一致性的同源检索，发现南瓜实蝇OBP2、OBP8、OBP9三者的匹配度分别为30.97%、30.09%和46.28%，相似性均大于30%，可用于下一步试验.经构建空间构像模型发现，OBP2、OBP8和OBP9三维模型分别有91.94%、92.92%和95.12%的氨基酸残基处于最佳区域，且最佳区域均大于90%，说明南瓜实蝇OBP2、OBP8、OBP9三个蛋白的模型比较合理，在空间上也具有传统的6个α螺旋结构，符合OBPs的保守结构特征，并对其进行优化处理得到3个南瓜实蝇OBPs的三维模型，具体见图1，保存用于分子对接。

图1 南瓜实蝇OBP2、OBP8、OBP9三级结构预测图

2.1.2 配体分子的三维结构下载及优化

通过查询十七烷、十八烯、D-香茅醇和D-柠檬烯4种小分子配体的CAS号，使用Pubchem数据库下载其三维结构（见表 1），运用ChemBio3D对十七烷、十八烯、D-香茅醇、D-柠檬烯进行立体空间结构构建和最小能量优化，4种小分子配体的三维结构具体见图 2。

表1 4种小分子配体的相关信息

图2 4种小分子配体的三维结构

2.2 分子对接

2.2.1 南瓜实蝇OBP2分子对接

南瓜实蝇OBP2的空间对接结构（图 3）与4种小分子配体对接效果如图 4-A、B、C、D，当CSCORE值≥4时，crash越接近于0，polar越大，说明对接结果与实验相似度较高，对接结果较好，反之对接结果不可靠。由表2可知，OBP2与D-香茅醇对接CSCORE值为4，综合打分函数为4.2322，OBP2与D-柠檬烯对接CSCORE值为4，综合打分函数为3.1346，对接结果有效，且结合模式较优；但OBP2与十七烷和十八烯的CSCORE对接值仅为1，打分函数分别为4.0986、3.6238，对接结果不可靠.综上表明D-香茅醇、D-柠檬烯可与南瓜实蝇OBP2相结合，但D-香茅醇的结合作用优于D-柠檬烯（因为D-香茅醇的polar值高于D-柠檬烯的polar值），因此这2种小分子物质可作为该昆虫的行为干扰剂。

表2 南瓜实蝇OBP2与4种小分子配体的对接情况

图3 南瓜实蝇OBP2 空间结构

图4 南瓜实蝇OBP2与4种小分子配体的对接图

2.2.2 南瓜实蝇OBP8分子对接

通过分子对接发现南瓜实蝇OBP8的空间结构（图5）可与4种小分子配体进行对接（对接效果如图6-A、B、C、D），发现OBP8与D-香茅醇和十七烷的对接CSCORE值为4，且综合打分函数均高于4，因此对接结果有效，结合模式较优.而OBP8与D-柠檬烯和十八烯的对接CSCORE值分别为3和1，均低于4，综合打分函数也低于4，对接结果不可靠（表3）。综上表明D-香茅醇、十七烷能与南瓜实蝇OBP8相互作用，但D-香茅醇的作用优于十七烷（因为D-香茅醇的polar值高于十七烷的polar值，crash值更接近于0），因此这2种小分子配体可作为该昆虫的行为干扰剂使用。

表3 南瓜实蝇OBP8与4种小分子配体的对接情况

图5 南瓜实蝇OBP8空间结构

图6 南瓜实蝇OBP8与4种小分子配体的对接图

2.2.3 南瓜实蝇OBP9分子对接

南瓜实蝇OBP9的三维模型空间对接结构如图7，其与4种小分子配体的对接效果如图8-A、B、C、D。由表4可知，OBP9与D-香茅醇、十七烷的对接CSCORE值均为4，综合打分函数均高于4，对接结果有效，且结合模式较优；且由于D-香茅醇的polar值较大，crash值更接近于0，因此D-香茅醇与OBP9的结合作用更为紧密，表明这2种小分子配体都可以作为该昆虫的行为干扰剂.而OBP9与D-柠檬烯和十八烯的对接CSCORE值较低，对接结果不可靠，相互间作用较小。

表4 OBP9与4种小分子配体的对接情况

图7 南瓜实蝇OBP9空间结构

图8 南瓜实蝇OBP9 与4 种小分子配体的对接图

3 小结与讨论

在已知OBPs序列的昆虫中，利用NCBI寻找近源种的OBPs基因序列，通过同源建模和分子对接后，可初步筛选得到与之结合的小分子配体物质和探寻该类蛋白的结合特性等内容，该方法已被应用于茶尺蠖（Ectropis obliqua）、紫榆叶甲（Ambrostoma quadriimpressum）、苜蓿盲蝽（Adelphocoris lineolatus）等昆虫OBPs的结合特性研究中。[7，8，13]一般情况下，同源性大于30%时所得到的模型就是可靠的三维模型。[14]而本实验对南瓜实蝇OBP2、OBP8、OBP9的同源建模后的同源性均大于30%，可以开展分子对接实验。

气味结合蛋白（OBPs）是昆虫识别外界气味物质的特异性蛋白，大量研究发现昆虫对气味的趋向行为与OBPs有关，不同昆虫的OBPs能与不同挥发物质结合，且具有不同的生理功能。[15-17]不同种类的昆虫其OBPs与之对接的配体不同，且这些配体物质的作用也不尽相同.如蛾周氏啮小蜂（Chouioia cunea）OBP1能与γ-丁内酯、邻苯二甲酸二甲酯和萘结合，这3种寄主挥发物对该虫有明显的趋避作用。[14，18]而斑翅果蝇（Drosophila suzukii）OBP56h 能与β-环柠檬醛（该物质是草莓叶片产生的一种挥发性气味物质）结合，且对该虫具有吸引作用，同时该蛋白与苦味化合物中的盐酸小蘖碱及香豆素的结合亲和性较强，但不能与苯甲地那铵、N-苯基硫脲结合。[19-20]本文研究发现，南瓜实蝇OBP2与D-香茅醇、D-柠檬烯结合较好，OBP8与D-香茅醇、十七烷结合效果较好，而OBP9与D-香茅醇、十七烷对接效果较好，因此十七烷、D-香茅醇和D-柠檬烯可作为南瓜实蝇田间防治中的昆虫行为干扰剂使用，但具体干扰作用是引诱还是趋避还需进一步研究。