侧孢短芽孢杆菌对铜绿微囊藻藻际微生物群落的影响

陈 东，黄翔鹄，李长玲，张 宁，韦宏杰，张玉蕾

（1.广东海洋大学水产学院，广东 湛江 524088；2.广东海洋大学深圳研究院，广东 深圳 518108）

随着水体富营养化的加剧，有害藻华（Harmful algal blooms）在世界范围内广泛发生。其中蓝藻水华最为常见，会造成严重的水质问题[1]，如水体缺氧、污染饮用水和娱乐用水[2-4]，许多蓝藻还会产生有害的蓝藻毒素[5]，危害人类、牲畜、鱼类甚至农作物[6]。因此，寻找有效治理蓝藻水华方法尤为迫切。

采用物理方法清除蓝藻见效快，但成本相对较高，治标不治本；化学方法是用化学制剂直接杀死蓝藻，但专一性差，易造成二次污染[7]。溶藻细菌（algae-lysing bacteria）是以直接或间接方式，抑制藻类生长或杀死藻类、溶解藻细胞的细菌统称[8]。溶藻细菌用于生物控藻，有安全、经济、特异、高效、无二次污染等优点，已成为水质调控的应用热点，有望成为生物防治水华的有效手段[9]。

藻类和藻际细菌之间存在复杂的相互抑制或促进关系[10]。藻类分泌的胞外有机物质，为藻际细菌的生长繁殖提供营养[11]；藻际细菌也可产生藻类生长所必需的营养盐和必要的生长因子，并直接或间接促进或抑制藻类生长[12]，甚至裂解藻细胞[13]。翟春梅等[13]从铜绿微囊藻（Microcystis aeruginosa）细胞表面分离出一株藻际细菌甲基营养芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）Ma-B1，Ma-B1细胞对铜绿微囊藻的生长无显著影响，但一定浓度的Ma-B1胞外代谢物可显著抑制铜绿微囊藻的生长；铜绿微囊藻滤液可促进Ma-B1的生长，而高浓度铜绿微囊藻细胞（藻菌比10∶1）则可显著抑制Ma-B1的生长。菌藻之间复杂关系共同影响着藻、菌在自然水体中的消长。当有利于藻类生长的细菌在藻际群落中占优势时，可能会促进藻类的生长，而当抑制藻类生长的细菌占优势地位时，也可能会抑制或杀死藻类。因此，研究微藻的藻际细菌可更好地探讨藻类的藻际细菌动态变化，挖掘有特定功能的藻际细菌。

目前，对溶藻细菌的研究主要集中于溶藻细菌分离鉴定、溶藻现象的描述、溶藻方式及机理研究等[15-17]，关于溶藻细菌溶藻过程中藻类藻际微生物群落的变化鲜有报道。本课题组从湛江海滨公园水体分离出一株有溶藻效果的细菌，经16s rDNA测序分析，鉴定为侧孢短芽孢杆菌（Brevibacillus laterosporus）[16]。该菌的基因组已上传于NCBI（CP032848.1）。本研究用高通量测序方法，将单独培养的铜绿微囊藻藻际微生物群落和加入溶藻细菌后的藻际微生物群落进行对比，探究溶藻过程中藻际微生物群落的变化，为溶藻细菌的溶藻机理研究提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料

侧孢短芽孢杆菌Bl-zj（B.laterosporus）由广东海洋大学藻类资源开发与养殖环境生态修复实验室提供。铜绿微囊藻（M.aeruginosa）905购于中国科学院淡水藻种库。

1.2 方法

1.2.1侧孢短芽孢杆菌与铜绿微囊藻共培养 用BG11培养基对铜绿微囊藻905藻种进行多次传代与培养，使其形成稳定的藻际微生物群落，并用BG11培养基，于25 ℃、照度1 500 lx、12 h昼/12 h夜条件下培养7 d，达到对数生长期。侧孢短芽孢杆菌Bl-zj用牛肉膏蛋白胨液体培养基活化扩培，于30 ℃、150 r/min条件下培养12～18 h，达到对数生长期。

将铜绿微囊藻和侧孢短芽孢杆菌细胞密度均调节至1×107mL-1，分别取藻液和菌液各50 mL于1 L的锥形瓶，加BG11培养基至500 mL（BL组），对照组为50 mL铜绿微囊藻加BG11培养基至500 mL（BG组）[16]，光照培养箱中培养4 d后，分别离心收集共培养物和藻液。BL、BG组各设置3个平行实验。

1.2.2叶绿素a测定及溶藻效率计算 分别于0、1、2、3、4 d取10 mL样品，以5 000 r/min离心10 min，除去上清液，加入5 mL体积分数95%乙醇，振荡1 min，置于-20 ℃冰箱避光处理24 h后，以5 000 r/min离心10 min，取3 mL上清液分别测定于630、647、664、750 nm的光密度，叶绿素a含量（mg/L）计算[11]：

其中，D630、D647、D664和D750分别为630 nm、647 nm、664 nm和750 nm的光密度值；V1为提取液定容后体积（mL）；V2藻液体积（mL）；d为比色皿光程（cm）。

用叶绿素a含量代表铜绿微囊藻的生物量。用藻细胞去除率（R，%）作为溶藻细菌溶藻效果的参考指标。去除率R用下式[31]计算：

其中，ρ0为对照组藻细胞叶绿素a含量；ρ1为处理组藻细胞叶绿素a含量。

1.2.3总DNA提取、文库构建、测序 使用土壤DNA提取试剂盒（HiPure Soil DNAKits）从样本中提取基因组DNA后，用带有barcode的特异引物扩增16S rDNA的V3+V4区。引物序列为：341F：CCTACGGGNGGCWGCAG；806R：GGACTACHV GGGTATCTAAT[18]。回收PCR扩增产物，用QuantiFluorTM荧光计定量。将纯化的扩增产物等量混合，连接测序接头，构建测序文库，Hiseq2500 PE250上机测序。测序部分委托广州基迪奥生物科技有限公司进行。

1.2.4数据分析 测序得到原始数据（raw reads）后，过滤低质量读数（Reads QC filter）[19]，组装和再过滤，用Uparse软件对所有样品的全部有效标签（Effective Tags）序列聚类[20]，以97%的一致性将序列聚类成为OTUs（Operational Taxonomic Units），并计算每个OTU在各个样品中的标签（Tags）绝对丰度和相对信息，并进行OTU分析、物种组成分析、α多样性分析、PICRUSt群落功能预测。α多样性分析结果使用SPSS进行显著性分析。

Simpson指数（DS）计算：

其中，S表示物种种类的总数，Pi是样品中属于第i种的个体比例。

2 结果与分析

2.1 溶藻细菌bl-zj对铜绿微囊藻的溶藻效果

图1可见，与BG组相比，侧孢短芽孢杆菌与铜绿微囊藻共培养组的铜绿微囊藻叶绿素a含量显著减少，BG组0～4 d的叶绿素a质量浓度从0.36 mg/L增加到1.05 mg/L，而BL组的叶绿素a质量浓度下降至0.11 mg/L，4 d时铜绿微囊藻的去除效率达到89.55%。说明侧孢短芽孢杆菌Bl-zj对铜绿微囊藻有显著的抑制效果。

图1 两组铜绿微囊藻叶绿素a含量变化Fig.1 Changes of chlorophyll a content of Microcystis aeruginosa in two groups

2.2 OTU分析

2组样品获得高质量质控序列平均为85 390条，共聚成946个OTU，依据划分的OTU，比较两组样品间细菌群落结构的相似性。在PCA图中，OTU的距离越近，细菌群落结构的相似性越高，而不同环境间的样品往往表现出各自聚集的分布情况。图2表明，菌藻混合培养BL组和藻单独培养BG组聚集在不同的区域内，BL组聚集在右侧，而BG组在左侧，构成两个独立的组群[21]，表明与侧孢短芽孢杆菌Bl-zj共培养的铜绿微囊藻微生物组成和单独培养的铜绿微囊藻微生物组成有明显差异，这在铜绿微囊藻藻际微生物群落韦恩图（图3）中更为直观，两组相同的OTU有187个，BG组独有的OTU有420个，BL组独有的OTU有339个，虽然两组的微生物群落组成有相同之处，但差异已达50 %以上，显然是两个不同的微生物群落。

图2 铜绿微囊藻微生物群落结构的主要成分分析Fig.2 Principal component analysis of microbial community structure of Microcystis aeruginosa

图3 铜绿微囊藻微生物群落韦恩图Fig.3 Venn map of Microcystis aeruginosa microbial community

2.3 铜绿微囊藻微生物群落物种组成分析

优势物种很大程度决定着微生物群落的生态结构和功能结构，了解群落在各个水平的物种组成情况可有效解读群落结构的形成、改变及生态影响等。BL组共鉴定出23目，BG组共鉴定出24目，两组相对丰度前10的类群见图4_a。在BG组中，除去铜绿微囊藻所属的色球藻目（Chroococcales，70.48%），相对丰度较高的是根瘤菌目（Rhizobiales，6.32%）、醋杆菌目（Acetobacterales，5.96%）、假单胞菌目（Pseudomonadales，5.67%）和柄杆菌目（Caulobacterales，5.85%）。而在BL组中，相对丰度最高的是侧孢短芽孢杆菌所属的芽孢杆菌目（Bacillales），平均占比高达94.06%，色球藻目占比4.9%，其他类别不到2%。两组样品的微生物群落组成明显不同。

在样品属水平上，BL组共鉴定出35属，BG组共鉴定出39属，两组相对丰度前十的类群如图4_b所示。在BG组中，除去藻类（Microcystis，70.48%）和未分类（Unclassified，13.48%），相对丰度值最高的是假单胞菌属（Pseudomonas，4.91%），其余相对丰度由高到低分别为中慢生根瘤菌属（Mesorhizobium，3.18%）、短芽孢杆菌属（Brevibacillus，1.97%）和红杆菌属（Rhodobacter，1.48%）。而样品 BL 中短芽孢杆菌属（Brevibacillus，94.06%）占据绝对优势，与上述目水平分析相符合。

根据各物种目和属汇聚的丰度数据，将各物种在样品中的表达状况表现在热图中，根据热图上的物种聚类关系，可反映物种分布规律[22]。图5显示，在BL组，除侧孢短芽孢杆菌Bl-zj外的物种丰度显著降低，与BG组形成鲜明对比，说明侧孢短芽孢杆菌Bl-zj与铜绿微囊藻共培养会造成铜绿微囊藻微生物群落结构发生巨大变化，可破坏甚至消灭铜绿微囊藻原有的附生菌群。

2.4 铜绿微囊藻微生物群落物种多样性分析

α多样性是反映群落物种丰富度和均匀度的综合指标。Sobs表示样本中观察到的物种数目。由表1可见，BG组的Sobs值高于BL组，表明BG组观察到的物种数目高于BL组。Shannon指数和Simpson指数反映群落多样性。Shannon和Simpson指数越高，则群落多样性越高。表1表明，BG组的Shannon指数和Simpson指数均显著高于BL组，说明BG组中的生物多样性高于BL组。Chao1指数和ACE指数反映群落丰富度，Chao1指数和ACE指数越大，表明群落的丰富度越高。BG组的Chao1指数和ACE指数均明显高于BL组，说明BG组中的生物群落丰富度高于BL组。所有样本的覆盖率均大于99%，说明测序对物种的覆盖率较大，样本中未检测到序列的概率极低，证明测序结果可靠性高，可代表样本中微生物的真实情况。

图4 铜绿微囊藻微生物群落目（a）、属（b）水平种群分布Fig.4 Microbial community population distribution of Microcystis aeruginosa at the order (a) and genus (b) level

图5 铜绿微囊藻微生物群落目（a）、属（b）水平热图Fig.5 Microbial community heatmap of Microcystis aeruginosaat the order (a) and genus (b) level

表1 铜绿微囊藻微生物群落物种Alpha多样性指数Table 1 Alpha diversity index of microbial community of Microcystis aeruginosa

2.5 铜绿微囊藻藻际细菌功能预测

通过PICRUSt功能预测分析，比对KEGG数据库，获得153个代谢通路信息，将其划分至6种主要通路信息：基因信息处理（Genetic information processing）、环境信息处理（Environmental information processing）、新陈代谢（Metabolism）、细胞进程（Cellular processes）、组织系统（Organismal systems）和人类疾病（Human diseases）。其中与新陈代谢相关的基因丰度占比最高，人类疾病基因丰度占比最低。两组样品各代谢通路相关的基因丰度占比排名有一致性，基因丰度由大到小均依次为新陈代谢、基因信息处理、细胞进程、环境信息处理、组织系统和人类疾病。通过比对IMG（Integrated Microbial Genomes）数据库整理出20种功能分类（表2），其中基因丰度排名前 10由大到小依次为碳水化合物代谢（Carbohydrate metabolism）、氨基酸代谢（Amino acid metabolism）、脂质代谢（Lipid metabolism）、能量代谢（Energy metabolism）、外源生物降解与代谢（Xenobiotics biodegradation and metabolism）、复制与修复（Replication and repair）、细胞运动（Cell motility）、膜转运（Membrane transport）、核苷酸代谢（Nucleotide metabolism）和信号传导（Signal transduction）。图6可见，BG组和BL组的基因丰度有明显差异，在基因丰度前15的代谢通路中，除外源生物降解与代谢、能量代谢、细胞群落-原核生物外，BL组中各功能基因丰度均大于BG组，而BG组中细菌群落功能侧重外源生物降解与代谢以及能量代谢，也体现出菌藻间的能量物质交换。

图6 铜绿微囊藻微生物群落细菌的KEGG代谢通路相对丰度Fig.6 Relative abundance of KEGG metabolic pathway of Microcystis aeruginosa microbial community

3 讨论

本研究中，铜绿微囊藻905的藻际细菌以假单胞菌属（Pseudomonas）为优势属，中慢生根瘤菌属（Mesorhizobium）为次优势属。肖慧杰[23]在两株水华微囊藻（Microcystis flos-aquae,NJ-159，NJ-72）群体状态和一株惠氏微囊藻（Microcystis wesenbergii,NJ-24）单细胞状态下也发现了假单胞菌属，但不是优势属。周子元等[24]从太湖微囊藻中分离出三株假单胞菌和一株芽孢杆菌，与本研究结果较为吻合，本研究中也发现了短芽胞杆菌属（Brevibacillus）。过七根等[25]在铜绿微囊藻905鉴定出35株细菌，其中假单胞菌属和红细菌属本研究也有发现。范琦等[26]发现，铜绿微囊藻NJ-177的附生菌群中鞘氨醇单胞菌属为优势属，占附生细菌的40 %。Shi等[27]也在铜绿微囊藻附生菌群发现鞘氨醇单胞菌属，且为优势属。而在李孟珂[28]的研究中，铜绿微囊藻藻际细菌以气微菌属为优势属，未分离到鞘氨醇单胞菌属，也未分离出假单胞菌属。不同微囊藻的附生菌群可能存在一定共性，但更多的是差异。附着在藻类上的代谢能力、疏水性、自聚和共聚等细菌特性也会对藻际环境造成影响，这也是决定附生菌群种类组成的重要因素[29]。朱丽萍等[13]证实，相对于水体中的浮游细菌，附着在藻类群体上的细菌种群代谢活性更高。范琦等[26]也证实，在惠氏微囊藻（M.wesenbergii）、坚实微囊藻（Microcystis firma）、水华微囊藻（M.flos-aquae）和铜绿微囊藻（M.aeruginosa）的藻际环境中，附着细菌的特性有差异，细菌共聚能力不同，导致不同藻际环境中的优势菌种产生变化。

本研究中，侧孢短芽孢杆菌Bl-zj是一株溶藻细菌。研究证明，Bl-zj主要通过分泌胞外活性物质杀死蓝藻[16]。本研究发现，在溶藻过程中，Bl-zj破坏了铜绿微囊藻的藻际细菌群落，可能在溶藻过程中，某些对铜绿微囊藻生长有利的细菌受到Bl-zj的抑制，使铜绿微囊藻的营养吸收或其他方面受到负面影响，这可能辅助了Bl-zj的溶藻进程。研究证明，在蓝藻周边环境附生的细菌群落可保护宿主藻细胞免受外界不良物质的侵害，细菌群落还可直接或间接地处理掉较多代谢废物，促进藻细胞的健康发育[28]。邹迪等[30]研究发现，藻际细菌假单胞菌可促进对数期铜绿微囊藻细胞的生长，假单胞菌对水体中的含磷细胞物质进行吸收利用，再分解为磷酸盐提供给微囊藻。Jiang等[31]也发现，磷在铜绿微囊藻及其藻际细菌假单胞菌间可以转移，当铜绿微囊藻的生长进入滞后期，藻际细菌可释放大量的磷，使微囊藻的同化较易进行。另外，一些研究表明，假单胞菌属菌株有降解烷基酚类和芳香族化合物等持久性有机污染物的能力，紫杆菌属菌株也具有降解芳香烃和石油等合成有机物的能力[32]。在藻际环境稳定的情况下，一些藻际细菌可与藻类进行物质交换，为藻类生长提供营养，一些藻际细菌可分解有害物质，保护藻类和藻际环境的稳定。但是侧孢短芽孢杆菌Bl-zj的加入，使藻际细菌多样性显著下降，芽孢杆菌属细菌成为优势属，抑制甚至消灭了其他藻际细菌，对铜绿微囊藻的藻际环境造成巨大的破坏。可能是由于生态位的竞争和替代，或者是Bl-zj分泌的胞外物质对其他藻际细菌也有抑制效果。藻际环境的破坏以及对铜绿微囊藻生长有益的藻际细菌消失可能导致铜绿微囊藻生长所需营养物质短缺，加速了铜绿微囊藻衰亡进程。

本研究中，侧孢短芽孢杆菌Bl-zj对藻际环境的细菌群落有较强的破坏作用，与BG组相比，BL组中细菌多样性显著降低，这也为研发新型除藻剂或控制有害藻类提供新思路：通过破坏藻际环境平衡，使有抑藻效果的细菌成为藻际微生物群落优势群体的手段而达到溶藻效果。这需要更加深入地研究藻际细菌的变化对铜绿微囊藻的影响，以及菌藻之间的相互作用机理等。本研究中，细菌培养基的加入是否会对藻际细菌组成造成影响，是进一步研究中需注意的问题。