浅淡水产品中硝基呋喃类代谢物检测能力验证体会

○杨惠宇 潘发林

能力验证是通过各实验室之间的比对，来对一个实验室的能力进行考核。能力验证是检验实验室检测水平的有效手段，也是保证实验室质量管理体系得到有效改进的措施之一，有利于实验室自我完善，它不仅体现检测人员的技术水平，更是实验室检验能力的一种体现。为了提高实验室检测能力，在做好实验室内部质量控制的同时，我实验室自2016年通过硝基呋喃类代谢物检测认证后每年都积极参加农业农村局组织的能力验证。单位需要在样品签收后96 h之内完成检测工作并上报结果，报告需附称样记录、标准溶液配制记录、谱图以及标准曲线等，回收率在70%-120%之间判定结果为满意。

1 准备工作

1.1 实验人员

检测人员在检测前要做好个人防护，按照检测方法要求准备相应的检测试剂、器皿、仪器设备等，并按照标准方法配制试剂、标注溶液等。检测人员要充分了解实验原理、熟悉实验步骤、能够正确处理实验中每个环节，将操作误差降到最低，使整个检测过程的质量有所保障。

1.2 环境条件要求

在实验之前将实验室温度调节到适宜温度，实验前处理室以及仪器室的温度应控制在22-25℃。

1.3 准备器皿

准备实验中将要用到的器皿，配制溶液时要使用经过检定计量合格的移液器或器皿，所有器皿在使用之前需要验证是否漏液，新的器皿用纯水清洗，用过的器皿用甲醇清洗，确保没有残留；必要的时候用甲醇等试剂超声清洗。

1.4 标准溶液的配置

检查标准物质证书，确认标准物质是否在有效期内，根据标准物质的纯度以及分子量进行换算。将8种标准物质按照标准的要求进行配置，分别配置成浓度为100μg/mL的同位素内标溶液，以及浓度为1.0 mg/mL的标准储备溶液待用，4℃条件下保存期为180天。难溶的物质可通过超声帮助溶解。将同位素内标溶液和标准储备液分别用纯水逐级稀释成浓度为10 ng/mL和100 ng/mL的工作溶液。稀释时徐将储备液放置至室温，观察是否有晶体析出，如果有晶体析出需要重新摇匀至溶解后再进行稀释。

1.5 所需药品及配制

盐酸溶液：0.2 mol/L；

二硝基苯甲醛（2-NBA衍生化试剂）：0.05 mol/L；

乙酸铵溶液：0.002 mol/L；

二甲基亚砜（国产）、磷酸氢二钾（国产）、甲酸、乙腈（色谱纯）、甲醇（色谱纯）、乙酸乙酯（色谱纯）等。

1.6 仪器条件优化

仪器设备的准确性是影响实验结果的关键性因素之一，对实验中所需的仪器设备进行核查，确认仪器检定校准是否在有效期内，是否能够满足实验要求，可通过新配置的标准溶液进行验证，确保准确无误。若新配置的标准溶液灵敏度不够高，需要优化仪器和检测条件，可更换色谱柱、清洗离子源等，且控制液质室温度为22-25℃。可提前将仪器优化到最佳状态待用。

1.7 质控样品制备与练习

按照检测方法提前准备质控样品，将阴性控制样品（空白样品）中加入已知浓度的标准物质冷冻过夜，可作为回收率试验、平行试验练习样品。按照作业指导书要求将质控样品作为待测样品进行前处理练习，并上机检测，进一步熟练检测步骤。

2 样品处理

2.1 核验样品

检查样品编号是否正确，确认样品是否有效，如考核样品呈完全解冻状态或者运输时间超过72 h则为无效样品，需安排重新领取样品。有效样品需要立即开展实验，不可放置过夜。样品操作过程中尽量避光。

2.2 标准曲线的建立

本实验选择六个浓度点，分别为0.25、0.5、1、2.5、5、10 ng/mL，由于硝基呋喃类代谢物的标准曲线需要进行衍生化处理，因此标注曲线与待测样品同时进行前处理。

2.3 样品衍生化

待样品自然解冻后，按照能力验证文件要求，称取3个平行待测样品和空白样品，检测过程试剂空白和样品空白需同步进行。质控样品可选择空白样品加标，添加浓度一般为2-5倍定量限，也可选择购买已知浓度的质控样品，同时确保质控样品和待测样品在相同条件下进行前处理，保证操作步骤的一致性，将误差降到最低。分别称取2.00 g空白样品于50 mL离心管中备用。首先加入50 μL同位素混合内标工作液，涡旋混合器混合50 s，再加入5 mL盐酸溶液，300 μL二硝基苯甲醛溶液，涡旋混合器混合50 s，然后置于超声清洗仪中超声2 h，水温控制在35℃左右，以上操作过程尽量避光操作。超声结束后将样品置于摇床中，温度设置为37℃，恒温震荡17h。

2.4 样品前处理

取出样品，冷却至室温，首先加入磷酸氢二钾溶液调pH值到7.4（±0.2），再加入4 mL乙酸乙酯，涡旋混匀60 s，4 000 r/min离心5 min，重复提取一次，合并上清液直接过Prime HLB固相萃取小柱，收集滤液至10 mL离心管中，38℃水浴氮气吹干。准确加入1 mL甲醇（20%）-水溶液，涡旋混匀60 s，如果样品油脂过多，可用低温高速离心机13 000 r/min离心10 min，取下层溶液过0.22 μm滤膜，准备上机检测。

2.5 上机检测

本方法采用ACQUITY UPLC®BEH C 18柱；柱温：35℃；流动相：A为2 mol/L乙酸铵水溶液，B为甲醇溶液；流速为0.3 mL/min；进样量为10 μL。

ESI正离子化模式；仪器型号：Waters Xevo TQS；离子源：电喷雾离子源（ESI）；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应检测（MRM）；锥孔电压：40 V；毛细管电压：0.9 kV；脱溶剂气温度：50℃。

3 结果分析

首先检查谱图，看是否有积分不准确的情况，在积分准确的情况下通过对质控样品回收率的分析，判断此次实验的质量控制情况，通过对质控样品的分析，判断此次能力验证的结果偏高还是偏低。其次比较试剂空白和样品空白谱图，判断是否在操作过程中有杂质引入以及基质干扰。最后仔细分析待测样品的数据以及谱图，判断三个平行样品之间重复性是否良好，计算质控RSD以及品行待测样品RSD并上报结果。根据能力验证文件要求及时在网站上报数据，并邮寄原始记录等，原始记录要求手写并签字。检测结果见下表。

2020年水产品中硝基呋喃类代谢物能力验证情况(ND表示未检出)

4 能力验证体会

随着水产养殖业的发展，养殖面积的扩大，水产品的质量安全问题日益凸显，食品安全问题成为老百姓越来越关注的问题。作为检测机构，提高检测能力、熟练掌握检测方法、保证检测质量是关键。只有提高检测机构的检测能力，才能更有效的保障水产品的质量安全。而能力验证结果是实验室管理水平和检测人员检验能力的综合体现，积极参加能力验证对实验室技术水平、检验人员的操作水平都有一定程度的提高。通过对能力验证结果的分析，可发现自身与其他实验室之间的差距与不足，以及实验室在技术管理上的缺陷，从而保证实验室与其他检测结构检测能力持平。能力验证结果为满意，在一定程度上增强了检测人员的信心，进一步提高了本实验室出具数据的可信度。对于水产品硝基呋喃类代谢物能力验证掌握前处理方法和上机操作是关键，要加强检测人员的技术水平，从实验前期开始准备，把能力验证作为实验室的基本要求，只有检测水平提高了，监管水平才会提高，水产品的质量安全才会得到保障，我们的检测才是有意义的。

（通联：130033，吉林省长春市水产品质量安全检测中心）