和肤洗剂中抑菌剂的抑菌效力评价

章瑛，刘彭浩邦，刘绪平，张春华

1.江西省药品检验检测研究院，国家药品监督管理局中成药质量评价重点实验室，江西省药品与医疗器械质量工程技术研究中心，江西 南昌 330029；2.江西中医药大学，江西 南昌 330004

和肤洗剂具有清热解毒、化湿润燥、止痒收敛的功效，主要可用于疥疮、湿疹、脂溢性皮炎、瘙痒性皮肤病和花斑癣［1-2］。和肤洗剂处方中主要由紫花地丁、白鲜皮、苦参、蛇床子等八味药材组成，本身具有很强的抑菌效力，可以有效地解决大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌等引起皮肤瘙痒的问题［3-6］。但对白色念珠菌和黑曲霉的抑菌作用很弱，而真菌的污染和其繁殖能力很强，它对人体的危害很大，会引起系统性感染，其中严重危害生命的深部真菌感染目前呈上升趋势。对于皮肤给药的液体制剂而言，在存储和使用过程中容易被微生物污染，为确保药物制剂使用时的安全性，药品中应加入抑菌剂且应该为其最低有效量［7-9］。

1 实验材料与菌种

1.1 实验菌种

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）［CMCC（B）10 104］；大肠埃希菌（Escherichia coli）［CMCC（B）44 102］；金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）［CMCC（B）26 003］；白色念珠菌（Candida albicans）［CMCC（F）98 001］；黑曲霉（Aspergillus niger）［CMCC（F）98 003］（菌种均由中国医学菌种保藏中心提供）。

1.2 实验仪器

高压蒸汽灭菌器HVA-85 日本Hirayama 公司；微波炉D8523CTL-2W 顺德格兰仕微波炉电器有限公司；电子天平Quintix6101-1CN 北京赛多利斯仪器系统有限公司；生物安全柜AB2-4S1 新加坡ESCO 科技有限公司；生化培养箱IPP260 德国美墨尔特有限公司；霉菌培养箱 KB400 德国BINDER 有限公司；水浴锅HH.W21.601S 上海跃进医疗器械厂

1.3 培养基批号及来源

被检胰酪胨大豆琼脂培养基（批号：190704，生产单位：北京三药科技开发公司）被检沙氏葡萄糖琼脂培养基（批号：20190310，生产单位：北京奥博星生物技术有限责任公司）

胰酪胨大豆琼脂对照培养基（批号：135025-201804，生产单位：中国食品药品检定研究院）沙氏葡萄糖琼脂对照培养基（批号：135013-201703，生产单位：中国食品药品检定研究院）

1.4 样品

含不同浓度抑菌剂的样品，见表1。

表1 和肤洗剂中防腐剂以及浓度

2 方法

2.1 菌液制备

按照《中国药典》2015 年版四部标准中规定程序，接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌、黑曲霉进行培养，然后用稀释剂制成适宜的浓度备用试验。试验用菌株均属于第3 代。

2.2 计数方法适用性试验

供试品微生物计数中所使用的培养基应进行适用性检查，供试品的微生物计数方法应进行方法适用性试验，以确认所采用的方法适合于该产品的微生物计数。

2.3 抑菌效力的测定

按照《中国药典》2015 年版四部（通则1121）抑菌效力检查法的要求，分别接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌菌和黑曲霉，按“2.2”项下经验证的计数方法观察几组对5 株菌的存活情况进行测定，并按照上述法规中的标准进行结果分析。

3 实验结果

3.1 培养基适用性检查

按规定程序新鲜配制胰酪胨大豆琼脂和沙氏葡萄糖琼脂培养基（被检培养基和对照培养基），121 ℃灭菌15 min，备用。

取12 个无菌平皿，分别接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌、黑曲霉各两皿，每皿接种1 mL 菌液（含菌50～100 cfu），另一平皿不接种菌作为空白对照，倾注对照培养基，混匀，凝固后倒置培养；被检培养基同法操作。结果见表2。

表2 培养基适用性检查

3.2 供试品计数方法学适用性试验

取样品（含苯甲酸钠0.2%+羟苯乙酯0.02%），采用平皿法对5 株菌进行计数方法学适用性试验，结果各试验菌回收率均≥70%，符合药典要求。

回收率的计算：（试验组的平均菌落数―供试品对照组的平均菌落数）/菌液组的平均菌落数×100%，各试验菌回收率均≥70%，结果一次独立平行试验中各试验菌回收率均大于70%，说明采用平皿法（1∶10）不影响各菌的生长，可以用来计数，由此表明本品抑菌效力检查方法可采用平皿法（1∶10），结果见表3。

表3 方法适用性试验

3.3 抑菌效力的测定

每组样品取5 支，每支接种一个试验菌，每1 mL 供试品接种菌量为105～106cfu，接种菌液的体积不得超过供试品体积的0.5%～1%，充分混合，使供试品中的试验菌均匀分布。然后将接种的供试品在试验期间置25 ℃，避光贮存，贮存温度的变化应尽可能控制在最小范围，并防止被污染。

分别于接种2、7、14、28 d 进行样品中的微生物计数，对比初始加菌量，进行结果分析，结果见表4。

表4 抑菌效力试验结果

4 讨论

抑菌剂也叫作防腐剂，是指抑制微生物生长的化学物质，主要作用在于抑制微生物的繁殖增长，防止微生物污染而影响药品质量。若药品本身不具备或没有足够的抑菌作用，为了防止药品在储存和使用过程中被微生物污染，应在药品中适量加入抑菌剂，特别是多剂量使用需要反复打开的药品制剂。抑菌剂本身是一种化学物质，具有一定的毒性，使用过程中对人体都有一定的毒副作用，所以为确保药物制剂使用时的安全性，药品中使用的抑菌剂都应该为其最低有效量，且能发挥正常的抑菌效力。

根据《中国药典》及其他标准制定的防腐剂控制标准指导，针对液体制剂的性质，笔者选用山梨酸类、苯甲酸类以及尼泊金类三种抑菌剂，不同的抑菌剂具有不同的用量和作用机制：山梨酸类常用量为0.15%～0.20%，主要用于酸性制剂，尤其pH值4.5左右的防腐效果最佳，其对霉菌抑制作用较强；苯甲酸类常用量为0.1%～0.3%，其在pH 值4 以下的抑菌作用强，作用主要靠未解离的分子，pH 值升高时，解离度增大，抑菌效力下降；尼泊金类常用量为0.05%～0.15%，对液体制剂的防发霉有效，尤其适用于中药水性制剂。

综合上述研究结果显示可以得出，和肤洗剂本身对细菌具有一定的抑菌效力，但对白色念珠菌和黑曲霉的抑菌作用很弱，而加入山梨酸钾抑菌剂时，增强了对真菌的抑菌作用，对细菌亦有一定的抑制，尤其对铜绿假单胞菌更为明显，苯甲酸钠防发酵能力较羟苯乙酯强，但防发霉能力较后者弱，故两者联用对液体制剂的防发酵和防发霉均有效，尤其适用于中药水性制剂。参照《中国药典》抑菌效力标准以及防腐剂控制标准，建议以“苯甲酸钠0.1%+羟苯乙酯0.02%”作为和肤止痒洗剂中最适宜的抑菌剂以及最低有效浓度。

（续表）