天然胶原交联剂在牙本质粘接领域中的研究进展

张 炜，王景云

（吉林大学口腔医院，长春 130021）

在过去的几十年中，树脂-牙本质粘接技术一步步发展，在牙体缺损修复上取得了相对可靠的临床效果，但与牙釉质粘接相比其粘接持久性仍存在着欠缺[1]。牙本质结构特殊，有机物含量约占其体积的30%，其中胶原蛋白占绝大多数，主要为Ⅰ型胶原。牙本质粘接修复的粘接力主要依赖于酸蚀后脱矿牙本质表层的胶原纤维网和粘接剂所组成的混合层（hybrid layer，HL）[2]，混合层的质量对树脂修复体的粘接强度和使用寿命至关重要。由于树脂单体在脱矿后的牙本质胶原纤维内的渗透渐进性的特点，导致酸蚀的深度与树脂渗透的深度不一致从而在混合层底部产生裸露的胶原纤维区域，此区域内残留的水分子会使溶解的树脂析出，同时被激活的牙本质内源性胶原蛋白水解酶也会使裸露的胶原纤维逐渐发生降解[2][3]，混合层结构崩塌，从而影响牙本质粘接的耐久性。

在牙本质粘接的实验室研究中，已经发现天然来源的交联剂可以通过增加胶原纤维间和纤维内共价交联的数量，改善牙本质粘接的耐久性，胶原蛋白交联被认为是增强脱矿牙本质基质对内源性酶降解的抵抗性的有效方法，并可获得具有改善机械强度的稳定混合层，有研究通过使用交联剂预处理酸蚀后的牙本质人为地增加了胶原蛋白原纤维的稳定性[4][5][6]。天然胶原交联剂按化学结构分为天然多酚类（原花青素、表没食子儿茶素没食子酸酯、槲皮素、单宁酸、姜黄素和贻贝蛋白等）、环烯醚萜类（如京尼平）和大分子多糖类（如海藻酸）。

1 天然多酚类

1.1 原花青素（PA）

原花青素主要来源于植物，其中葡萄籽提取物（GSE）为最主要的来源之一，属于缩合单宁类，是高度羟基化结构，能够与蛋白质形成不溶性复合物，在发育过程中增加胶原蛋白的合成并加速可溶性胶原蛋白向不溶性的转化[7]，稳定并增加了I 型胶原原纤维的交联[4]。有研究表明低浓度的PA可通过改变化学性能并提高脱矿质牙本质的机械性能，使用6.5%GSE分别处理脱矿牙本质基质10min和4h，测量其刚度增加了约8~40倍[6]，它与戊二醛和胶原蛋白的作用机制不同，PA 和胶原蛋白的相互作用主要通过蛋白质酰胺羰基和酚羟基之间的氢键导致外源性交联，而其产生的疏水键又会减少水的吸附，相对于其他多酚类物质拥有相对较大的结构稳定性，此外，PA 还可通过隐藏或者修饰胶原蛋白分子内酶的切割位点来抑制基质金属蛋白酶的活性[7]。

1.2 表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）

表没食子儿茶素没食子酸酯，一种绿茶多酚，已被证明可抑制了基质金属蛋白酶（MMP）-2 和基质金属蛋白酶（MMP）-9 的明胶分解活性，体外研究表明，EGCG 可以通过降低牙本质中的MMPs 活性阻止牙本质被酶解[8][9]。EGCG是具有最强牙本质交联能力的单体儿茶素，它对胶原蛋白的机械性能和抵抗蛋白水解降解的稳定作用都具有积极作用，即使在低至0.0065%的浓度下也显示出对MMPs 的抑制作用[10]。EGCG 结构中含有酚羟基，通过亲水性的羟基与胶原纤维形成氢键以及芳香环的疏水相互作用共同稳定胶原蛋白，另外它对金属离子具有很高的亲和力，金属离子与EGCG 结合后会阻止MMP 的识别能力进而抑制胶原蛋白分解[11]。

1.3 槲皮素（quercetin ）

槲皮素是饮食中最常见的黄酮醇，可下调在前列腺癌细胞中MMP-2 和MMP-9 的表达[12]。槲皮素的分子结构与原花青素单体儿茶素或表儿茶素相似，因此槲皮素交联也可能与基质蛋白的酚羟基和酰胺羰基或羟基之间的氢键形成有关[13]。粘接剂中的槲皮素可以与牙本质胶原交联，这种能力使槲皮素在牙本质基质中保持相对稳定，其细胞毒性浓度又比机制明确的化学胶原交联剂戊二醛低100 倍，同时Mirzoeva 已经证明槲皮素可以通过解耦能量传导细胞质膜并抑制细菌运动，从而产生抗菌作用，将500μg/mL 槲皮素掺入粘接剂中，可以达到抗菌改性，粘接强度和细胞毒性三者的平衡状态[14]。

1.4 单宁酸（Tannic acid）

单宁酸是一类特殊的可水解丹宁酸，以葡萄糖作为核心，葡萄糖的羟基被五个没食子酸基酯化[15][16]。单宁酸通过交联纤维状胶原蛋白和抑制MMP来防止胶原蛋白基质降解，单宁酸与富含脯氨酸的蛋白（如弹性蛋白和胶原蛋白）中的疏水区特异性结合形成多个氢键证明了其在酶稳定性方面的作用[15][17]。最近，Jackson 等人研究了单宁酸在稳定胶原蛋白抵抗胶原酶作用中的作用，并发现含没食子酰基的多酚（如单宁酸）可能通过与单宁酸结合而抑制胶原酶的活性[15]。另有研究表明，单宁酸通过氢键结合到胶原分子形成了稳定的单宁酸-牙本质基质复合物增加了脱矿质牙本质基质的弹性模量，显著改善牙本质基质性能和树脂-牙本质结合强度[18]。

1.5 贻贝黏附蛋白（Mussel adhesion protein，MAP）

海洋贻贝是至今研究最为广泛的附着动物之一，贻贝粘附蛋白是海洋贻贝分泌的一种蛋白质，是海洋贻贝牢固附着在潮湿表面上的关键组成部分。贻贝粘附蛋白的粘合性能主要因为结构中含有3，4-二羟基-苯丙氨酸（DOPA）。DOPA 包含具有氢键和金属配体能力的邻苯二酚基[19][20]。科学家在粘接剂中添加了模仿贻贝黏附蛋白的物质形成了邻苯二酚聚合物，有效改善了被人工唾液污染的牙本质表面的树脂粘接强度[21]。随着仿生技术的进步，未来的牙本质粘合剂单体可能包含源自水生动物（例如贻贝和藤壶）分泌的蛋白质，这使得它们对粘接物的表面能的依赖性降低，并且不易被水解降解[22]。

2 环烯醚萜类

京尼平（genipin，GE）从栀子果实中提取的天然交联剂，属于环烯醚萜类化合物，其细胞毒性很低，比戊二醛低约10000 倍，被称为低毒交联剂，可以有效提高其对酶消化的抵抗力减缓胶原蛋白的降解[23]，并改善其机械性能[24][25][26]。有实验验证了京尼平与胶原分子内或相邻胶原分子之间的赖氨酸（Lys），羟赖氨酸（Hyl）或精氨酸的游离氨基反应，使赖氨酸（Lys）和羟基赖氨酸（Hyl）残基以浓度依赖性方式显着降低，形成分子内或分子间新的交联键[27]，使用京尼平处理牙本质胶原40h 后其拉伸强度值增加了约80%[28]。目前，有关京尼平交联的研究多集中于巩膜及心包膜支架方面，在牙本质粘接强度方面多用于几种交联剂之间的比较研究，其对牙本质粘接耐久性方面的研究仍需深入。

3 大分子多糖类

海藻酸（alginic acid）是一种天然多糖，其结构中含的羟基和羧基通过酯化反应形成酯键与胶原蛋白的游离氨基反应实现胶原与海藻酸的共价交联，并且尚未观察到海藻酸交联材料的细胞毒性[29][30]。海藻酸可被高碘酸盐氧化并形成多个功能性醛基（藻酸盐二醛，ADA）。因此，ADA 可以使用其多个功能性醛基与戊二醛以相同的方式与游离氨基发生反应，发现ADA 不仅可以有效地交联生物组织，还可有效增强对生物组织酶促降解的抵抗力[31]。有研究表明经海藻酸处理后的胶原蛋白仍可以保持其三重螺旋结构，而保持胶原蛋白的结构完整性可以稳定胶原蛋白[32]。有研究使用2%ADA 处理脱矿牙本质使胶原纤维网保持蓬松同时抑制MMP-9活性，提高树脂牙本质粘接即刻及老化后的微拉伸强度[33]。

4 结语

天然胶原交联剂从植物中提取，来源广泛，在抑制基质金属蛋白酶的活性的同时可以对胶原纤维进行交联，用于牙本质表面可提高牙本质基质的稳定性和抗酶解能力，改善牙本质粘接耐久性，近些年来日趋成为牙本质粘接领域中的研究热点之一。不过天然胶原交联剂从实验室研究转入临床应用仍有较长的一段路要走，因其种类繁多，在不同的粘接体系中，交联剂的添加方式，添加浓度和作用时间仍需进一步探索，个别实验已经证明了部分天然来源的交联剂的低毒性甚至无细胞毒性，使其在牙本质粘接领域方面具有广阔的临床应用前景。