预针刺结合穴位注射对胃溃疡大鼠胃黏膜的损伤修复作用及机制探讨

程佑民 林静瑜 周 凡 黄培炜 陈 祺 许金森

1.福建省中医药科学院，福建福州 350003；2.福建中医药大学针灸学院，福建福州 350108

非甾体抗炎药（Non-steroidal Antiinflammatory Drugs，NSAIDs）相关性胃病是临床的常见病、多发病，严重者可出现大面积溃疡、出血，甚至危及生命等。目前临床上NSAIDs 相关胃病治疗药物中，常规剂量的H2受体阻断剂防治胃溃疡效果不佳，米索前列醇的不良反应发生率高、耐受性差[1-2]，质子泵抑制剂（PPI）长期应用可加重NSAIDs 相关性肠损伤、诱发胃癌等风险[3-4]。经络理论指导下的针灸疗法以其安全绿色、疗效特异走向世界[5]。针刺（灸）足三里穴预防与治疗胃黏膜损伤性疾病已有许多报道[6-8]，但将足三里“未病先防”与“既病防变”之功效联合并用的报道不多见，本研究采用足三里穴“未病之时”预针刺结合“疾病后”注射生理盐水的治疗方式，探讨针刺防治胃膜损伤的作用，初步分析其机制。

1 材料与方法

1.1 动物与分组

SPF 级雄性SD 大鼠，体重：200～220 g，由浙江省医学科学院实验动物中心提供，合格证号：SCXK（淅）2019-0002；大鼠适应性饲养5 d，随机分为空白对照组、模型对照组、西咪替丁治疗组、足三里治疗组，每组各8 只。

1.2 主要试剂

吲哚美辛对照品（S18048-5 g，纯度99%，源叶生物科技有限公司）；西咪替丁注射液（国药准字H35021176，规 格2 ml ∶0.2 g×10 支，批号：2005241，福州福药海王制药有限公司）；谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）试剂盒（A005-1-2，南京建成生物工程研究所）；超氧化物岐化酶（SOD）试剂盒（A001-3-2，南京建成生物工程研究所）；微量丙二醛（MDA）测试盒（A003-2-1，南京建成生物工程研究所）；4%多聚甲醛（XS191108，Servicebio）；HE 染色试剂 盒（G1120，Solarbio），中性树胶（G8590，Solarbio）；血红素氧合酶1/热休克蛋白32（HO-1）抗体（bs-2075R，Bioss）；核因子2 相关因子2（Nrf2）抗体（bs-1074R，Bioss）。

1.3 主要仪器

酶标仪（Varioskan Flash，Therom）；石蜡切片机（RM2235，Lecia）；组织包埋机（YB-7LF，孝感亚光）；组织脱水机（ZT-14V2，孝感亚光）；脱色摇床（TS-92，其林贝尔）；恒温箱（DYY-6C，北京六一）；微波炉（MM721AAU-PW，美的）；显微镜（MDL，Lecia）；数显恒温电子水浴锅（HH-6，常州国华）；离心机（ST16R，Therom）。

1.4 分组与预针刺

大鼠适应性饲养5 d 后按随机数字表法分为四组：空白对照组、模型对照组、西咪替丁治疗组、足三里治疗组，每组各8 只。分组后，足三里治疗组立即进行预电针干预，具体方法：大鼠每日固定于黑色弹性鼠套，待安静时，拉伸出左下肢，电针双侧足三里穴（电针参数：疏密波、刺激频率为2 Hz/10 Hz），20 min/（次·d），连续6 d；模型对照组、西咪替丁治疗组大鼠每日同时同等固定于鼠套20 min/（次·d），连续6 d，空白对照组不予任何处理。

1.5 造模与干预

预针刺结束后各组大鼠禁食不禁水18 h，第7 天模型对照组、西咪替丁治疗组、足三里治疗组大鼠腹腔注射35 mg/kg 吲哚美辛混悬液制备胃溃疡模型。吲哚美辛注射60 min 后，对西咪替丁治疗组、足三里治疗组大鼠进行干预，具体干预方法：西咪替丁治疗组于肌肉点注射西咪替丁50 mg/kg，足三里治疗组于双侧足三里穴注射生理盐水0.5 ml/kg。注射部位定位[9-10]：足三里定位于后肢膝关节外下方当腓骨小头下约5 mm处，肌肉点定位于膝关节内侧，与足三里平行肌肉丰厚的非经非穴点，避免其他经脉、穴位作用的影响。

1.6 取材与指标检测

1.6.1 血清SOD、MDA、GSH-Px 检测 吲哚美辛注射后7 h，各组大鼠腹腔注射1 0% 水合氯醛3 ml/kg、腹主动脉采血、离心、取血清，按南京建成试剂盒方法检测SOD、MDA、GSH-Px。

1.6.2 胃黏膜大体观察与胃溃疡指数计算 大鼠采血完毕，暴露胃部，结扎幽门，从贲门处注射3 ml 4% 多聚甲醛，结扎贲门，剪取整胃，置4%多聚甲醛中固定30 min，取出胃，剪开，轻洗去多聚甲醛，用电子游标卡尺测量胃黏膜出血点及溃疡点，采用Guth 法[11]计算胃溃疡指数（UI）。

1.6.3 胃组织病理形态学 观察剪取典型部位胃组织块1.0 cm×1.0 cm，置于4% 多聚甲醛固定24 h，常规脱水、石蜡包埋、切片，苏木素-伊红（HE）染色、光镜下观察胃组织病理形态学变化。

1.6.4 胃组织Nrf2、HO-1 免疫组化检测 另取空白切片脱蜡至水，抗原修复、PBS 洗涤、山羊血清封闭、一抗孵育、HRP 标记二抗孵育、DAB 染色、苏木精复染，0.1% 盐酸酒精分化，中性树胶封片，光镜100 倍下观察Nrf2、HO-1 大致表达，400 倍视野下随机选取4 张图片，采用IPP 6.0分析每张图片阳性表达的积分光密度（IOD），计算IOD/Area，取平均值。

1.7 统计学分析

采用SPSS 23.0 统计学软件对数据进行分析，计量资料以（）表示，采用t检验，资料符合正态分布，组间差异采用单因素方差分析，方差齐性时，多组间两两比较采用LSD检验，方差不齐时，多组间两两比较采用Dunnett T3法；资料不符合正态分布，组间差异采用K 个独立样本的非参数检验，组间两两比较采用Kruskal-Wallis H检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠胃溃疡指数比较

与模型对照组比较，西咪替丁治疗组、足三里治疗组的胃溃疡指数明显降低（P＜0.01）。见表1。

表1 各组大鼠胃溃疡指数比较（，n=8）

表1 各组大鼠胃溃疡指数比较（，n=8）

注：与模型对照组比较，**P ＜0.01；溃疡抑制率（%）=（模型对照组平均UI-治疗组平均UI）/模型对照组平均UI×100%；“-”表示无数据

2.2 各组大鼠胃黏膜组织形态学比较

肉眼可见，模型对照组大鼠胃黏膜外观损伤严重，胃黏膜变薄，皱襞减少，有明显的出血及溃疡点；西咪替丁治疗组、足三里治疗组胃黏膜外观损伤状况明显轻于模型对照组；光镜下，空白对照组大鼠胃黏膜层完整，上皮细胞和腺体排列整齐均匀，大小基本一致，胃小凹结构清晰，未见充血、肿胀；模型对照组大鼠黏膜上皮细胞变性、脱落、腺体排列紊乱、腺体与胃小凹之间分界模糊不清，部分黏膜层可见红细胞、水肿。西咪替丁治疗组、足三里治疗组胃黏膜上皮细胞脱落、变性较轻，胃小凹结构尚清晰，腺体排列局部紊乱，少见红细胞。见图1。

图1 各组大鼠胃黏膜病理形态比较（HE×200）

2.3 各组血清SOD、GSH-Px活力、MDA含量比较

与空白对照组比较，模型对照组大鼠血清SOD、GSH-Px 活力明显下降（P＜0.01），MDA 含量明显上升（P＜0.05）；与模型对照组比较，西咪替丁治疗组、足三里治疗组GSH-Px 活力升高（P＜0.05、P＜0.01）、MDA 含量下降（P＜0.01、P＜0.05），SOD活力呈一定升高的趋势，但差异无统计学意义。见表2。

表2 各组大鼠血清SOD、GSH-Px活力、MDA含量比较（，n=8）

表2 各组大鼠血清SOD、GSH-Px活力、MDA含量比较（，n=8）

注：与空白对照组比较，△P ＜0.05，△△P ＜0.01；与模型对照组比较，*P ＜0.05，**P ＜0.01

2.4 各组大鼠胃组织Nrf2、HO-1蛋白表达情况

Nrf2、HO-1 在大鼠胃黏膜组织胞浆、胞核均有表达，呈棕黄色或棕褐颗粒。与空白对照组比较，西咪替丁治疗组Nrf2 阳性表达减少（P＜0.05），足三里治疗组Nrf2 阳性表达增强（P＜0.05）；与模型对照组比较，西咪替丁治疗组Nrf2 阳性表达明显减少（P＜0.01），足三里治疗组Nrf2 阳性表达呈增强的趋势，但差异无统计学意义；与空白对照组比较，模型对照组、西咪替丁治疗组HO-1 表达明显减少（P＜0.05、P＜0.01）；与模型对照组比较，足三里治疗组HO-1 表达明显增强（P＜0.05）；与西咪替丁治疗组比较，足三里治疗组Nrf2、HO-1 阳性表达均增强（P＜0.01）。见图2、表3。

图2 各组大鼠Nrf2、HO-1 表达比较（×400）

表3 各组大鼠胃组织Nrf2、HO-1表达比较（IOD/Area，，n=8）

表3 各组大鼠胃组织Nrf2、HO-1表达比较（IOD/Area，，n=8）

注：与空白对照组比较，△P ＜0.05，△△P ＜0.01；与模型对照组比较，*P ＜0.05，**P ＜0.01；与西咪替丁治疗组比较，◇◇P ＜0.01

3 讨论

针灸疗效受诸多因素影响，除经脉、腧穴的主治功能外，个体的状态、疾病的进程[12-13]、针刺的刺激量、疗程[14-15]、调神得气[16-17]等对针灸效应的发挥亦十分重要。《灵枢·九针十二原》中提到“刺之要，气至而有效”[18]，说明“气至”是针刺起效的关键。《难经·七十八难》云“当刺之时，必先以左手厌按所针荣俞之处，弹而努之，爪而下之，其气之来，如动脉之状”[19]，详述了对“气至”的激发。《难经·八十难》又道“谓左手见气来至，乃内针”[19]，提出了“气至”应在针刺治疗前。良性的预针（灸）对多种疾病具有一定的疗效，现代研究表明，预针灸可能通过启动机体内源性保护体系，纠正疾病状态下生化、分子标记物的改变[20-22]。

足三里为足阳明胃经下合穴，“合治内府”，为治疗胃腑疾病首选穴位之一。笔者前期工作发现，单次针刺足三里（或穴位注射）对无水乙醇、非甾体抗炎药实验性急性胃溃疡疗效不够显著。在此基础上，本研究基于中医“治未病”的思想，采用防治结合的方案，通过预针刺足三里疏通经络、激发胃经经气，并在胃溃疡造模后足三里注射生理盐水，取得了较好的疗效，其胃黏膜保护作用与50 mg/kg 西咪替丁肌肉注射相当。

非甾体抗炎药胃黏膜损伤机制涉及多个方面，包括直接损伤胃黏膜屏障、抑制胃黏膜环氧化酶（COX）的活性、降低胃黏膜血流量、氧自由基损伤等[23]。其中，氧自由基参与了NSAIDs 胃病局部直接损伤和吸收后损伤的多个环节，SOD、GSH-Px 是机体重要的酶类自由基清除因子，MDA 可间接反映组织过氧化损伤程度。本研究结果显示，胃溃疡模型大鼠存在着明显的氧化还原失衡状态，SOD、GSH-Px 活力下降，MDA 含量升高；针刺足三里可一定程度地纠正这一状态。

Kelch 样环氧氯丙烷相关蛋白1-核转录相关因子2-抗氧化反应元件（Keap1-Nrf2-ARE）通路被认为是细胞抗氧化机制中最重要的通路，Nrf2 通过核转位，介导了HO-1、SOD、GST 等多种抗氧化物酶、药物代谢酶和药物转运体的表达和转录[24]，促进机体的抗氧化应激。诱导型HO-1 对氧化应激反应敏感，催化血红素、阻止游离血红素参与氧化反应。本研究中足三里治疗组胃组织Nrf2、HO-1 蛋白阳性表达升高，提示针刺足三里可能激活了Nrf2/HO-1 通路增强机体的抗氧化应激能力，促进胃黏膜修复。

综上所述，足三里预针刺结合穴位注射对吲哚美辛实验性胃溃疡具有保护与修复作用，其机制可能与抗氧化有关。