实时荧光定量PCR检测九香虫血淋巴液对肿瘤细胞凋亡相关基因表达的影响

杨佳琪段小凤徐小茜田建霞郭建军

(1.铜仁职业技术学院，贵州 铜仁 554300；2. 贵州大学昆虫研究所/贵州山地农业病虫害重点实验室，贵州 贵阳 550025)

九香虫作为传统药用昆虫已多次出现在临床药用上，近年来其对肿瘤细胞特有的功效引发学者们研究热潮，诸多学者对九香虫引起肿瘤细胞凋亡进行研究，结果证明，九香虫可引起肿瘤细胞凋亡，但其作用机制仍需进行试验研究[1,2]。故本试验采用特异性强以及灵敏性较好的荧光定量PCR方法从mRNA上检测九香虫血淋巴液作用于肿瘤细胞以后凋亡相关的基因表达，以此探究九香虫血淋巴液引起肿瘤凋亡的机制。

1 试验材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

主要仪器与试剂见表1。

表1 主要仪器与试剂

1.2 试验方法

1.2.1 供试细胞的处理

分别培养人胃癌SGC-7901细胞与人乳腺癌MCF-7细胞至指数生长期，采取倍比稀释方法，使得2种细胞浓度至107个·mL-1。具体处理浓度及加样体积见表2，放置二氧化碳培养箱中培养24h，利用0.25%的胰酶进行消化后，使用PBS缓冲液洗涤肿瘤细胞2遍。

表2 九香虫血淋巴处理

1.2.2 制备RNA及测定其浓度

利用TRIzol方法制取肿瘤细胞RNA，并对RNA完整性进行测定，条件控制设定为110V，20min。

1.2.3 引物设计及合成

选用life technology公司设计与合成的引物，见表3。

表3 引物

1.2.4 去基因组DNA和cDNA的合成

按照表2中顺序于冰上进行基因组DNA的反应液配置操作，将PCR仪条件设为42℃,2min，而后终止反应，于4℃的冰上骤冷,反应条件见表4。

表4 去基因组DNA反应(10μL体系)

按照表5中顺序于冰上进行反转录的反应液配置，PCR仪条件控制为37℃、15min，而后85℃、5s进行反转录聚合酶的灭活，最后使反应终止，放于4℃的冰水进行骤冷，反应条件见表6。利用RNase-free Water使cDNA稀释5倍，-20℃进行保存。

表5 反应条件

表6 反转录(20μL体系)

1.2.5 实时荧光定量PCR

各个样本的对应目的基因及内参基因重复3孔。按照表7中顺序进行试剂的配置，反应条件可见表8。

表7 反应条件

表8 荧光定量PCR的操作体系(20μL)

表9 反应条件

2 结果与分析

2.1 RNA电泳图及RNA浓度测定

根据表10样品顺序上样，方法选用琼脂糖凝胶电泳(DL2000 Marker)，图1所示18s条带及28s条带明显，5s较为模糊，从而确定RNA完整性的检测结果合格。将提取的完整RNA进行DNaseI处理后，利用PCR扩增测定所获取的RNA不存在污染，能用于后续试验。

表10 凝胶电泳样品顺序

2.2 溶解曲线

由图2的溶解曲线可看出，该PCR产物的引物特异性相对较好；图3的扩增曲线显示PCR扩增反应的特异性。

2.3 各样品相关凋亡基因的表达

采用实时荧光定量PCR方法对2种肿瘤细胞凋亡相关基因进行检测，了解其变化，结果以RQ(2-△△Ct)进行表示，结果见图4。经血淋巴液处理后的2种肿瘤细胞Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9与Bax基因mRNA表达较CK组显著上调，而Bcl-2基因的表达较CK组显著下调。另由图4可见，当血淋巴液浓度为2.65mg·L-1时，Caspase-8的表达比浓度为12.26mg·L-1时低；当血淋巴液的浓度为12.26mg·L-1，Caspase-8的表达和CK组结果更为接近，但仅从表11的结果，不能排除可能经过外源性凋亡通路及内源性凋亡通路的相互作用，从而使肿瘤细胞走向凋亡，后续仍需针对血淋巴液诱导肿瘤细胞凋亡机制进行深入研究[3-5]。

表11 相关凋亡基因数据处理