血清microRNA-9-5p在乳腺癌患者临床诊断中的应用

黄少浩，邹惠英，罗均胜，招雄民

中山市黄圃人民医院病理科1、外二科2，广东中山528429

乳腺癌(breast cancer)是一种临床常见的女性恶性肿瘤，病因复杂，与乳腺癌的家族史、绝经时间等有关，发病率占女性恶性肿瘤的第一位，早期发现和治疗提高预后的关键[1]。目前，乳腺癌患者主要通过CT、超声、MRI等影像学检查技术联合常规血清肿瘤标志物进行临床筛查和诊断，具有良好的检出效果[2-3]。临床常用的乳腺癌肿瘤标志物包括血清糖类抗原153(carbohydrate antigen 153，CA153)、CA125、癌 胚 抗 原(carcino-embryonic antigen，CEA)等，在复发转移乳腺癌的诊断中具有良好的应用效果，但其早期检出率仍有待提高[4]。寻找新的特异性的血清肿瘤标志物，提高乳腺癌的早期检出率，具有重要的临床意义。microRNA-9属于miRNA家族成员，参与调控胃癌、结直肠癌、宫颈癌等多种肿瘤的发生发展[5-6]。近年来研究显示，microRNA-9在乳腺癌患者中具有双向调节作用[7-8]，早期可以抑制乳腺癌的发生，中晚期可以促进乳腺癌的复发和转移，可以用于乳腺癌的预后评估。但microRNA-9在乳腺癌患者血清中的水平变化分析较少，对乳腺癌的诊断价值尚不清楚。因此，本研究检查了血清microRNA-9-5p在乳腺癌患者中的水平变化，并对比分析了其在乳腺癌诊断中的应用价值，以期为其早期诊断提供一定的理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2017年1月至2019年12月中山市黄圃人民医院收治的96例乳腺癌患者纳入乳腺癌组。纳入标准：均经影像学及病理组织学活检确诊为乳腺癌；年龄30～75岁，能积极配合检查，均获得本人及家属的知情同意。排除标准：合并严重感染者；存在其他系统恶性肿瘤者；存在免疫系统疾病者；处于妊娠期或哺乳期患者；存在严重心脑血管系统、血液系统疾病者；存在严重肝、肾功能异常者。以本院同期收治的96例乳腺良性疾病患者纳入乳腺良性疾病组。纳入标准：均经影像学或病理组织学检测为乳腺良性疾病患者，年龄30～75岁，能积极配合检查，均获得其本人及家属的知情同意。排除标准同乳腺癌组。以同期96例在我院健康体检的女性作为对照组。纳入标准：均经健康体检各指标在正常范围内者，年龄30～75岁，能积极配合检查，均获得其本人及家属的知情同意。排除标准同乳腺癌组。乳腺癌组患者年龄30～75岁，平均(51.82±9.76)岁；根据TNM分期[9]：Ⅰ期27例，Ⅱ期43例，Ⅲ期21例，Ⅳ期5例。乳腺良性疾病组患者年龄30～75岁，平均(51.42±9.77)岁；疾病类型：乳腺纤维腺瘤43例，乳腺小叶增生27例，乳腺囊肿19例，乳腺炎7例。对照组受检者年龄30～75岁，平均(51.54±9.82)岁。三组受检者的年龄比较差异无统计学意义(F=0.042，P＞0.05)。本研究经医院医学伦理委员会审核批准。

1.2 观察指标与检测方法于入组第2天清晨，采集受检者的空腹静脉血液3～5 mL，离心(3 500 r/min，10 min)，分离血清，置于-20℃冰箱暂存。采用化学发光免疫分析法(罗氏Cobas e602化学发光仪,德国Roche公司)检测所有血清样本中CA153、CA125、CEA水平，严格按操作说明进行操作。采用实时荧光qPCR法检测血清microRNA-9-5p水平，先经miRNeasyMini Kit试剂盒提取血清总RNA，经反转录试剂盒反转录为cDNA，进行qPCR反应(7500 RT-PCR系统，美国Applied Biosystems公司)，上游引物为：5'-CAACCTTGAGAACTGAATTCCATA-3'，下游引物为：5'-AAAGGTTGATCTCGTCTCTCTGTC-3'，以U6为内参，qPCR反应条件：95℃预变性5 min，95℃变性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸45 s，共40个循环，采用2-△CCT计算相对表达量。

1.3 统计学方法采用SPSS17.0软件对所得数据进行分析，符合正态分布的计量资料以均数±标准差(x-±s)表示，采用单因素方差分析比较三组间差异，SNK-q比较三组两两间差异；Pearson相关性分析血清microRNA-9-5p和传统肿瘤标志物与乳腺癌患者临床分期之间的相关性；采用受试者工作特征曲线(ROC)分析血清microRNA-9-5p和传统肿瘤标志物对乳腺癌的诊断价值，联合诊断采用Logistic回归分析建模得到联合预测概率，曲线下面积(AUC)表示预测价值，检验水准α=0.05。以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组受检者的血清microRNA-9-5p水平比较乳腺癌组患者的血清microRNA-9-5p水平明显高于乳腺良性疾病组和对照组，差异具有统计学意义(P＜0.05)，而乳腺良性疾病组患者的血清microRNA-9-5p水平与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05)，见表1。

表1 三组受检者的血清microRNA-9-5p水平比较(±s)

表1 三组受检者的血清microRNA-9-5p水平比较(±s)

注：与对照组比较，aP＜0.05；与乳腺良性疾病组相比较，bP＜0.05。

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表2 三组受检者血清肿瘤标志物水平比较(±s)

表2 三组受检者血清肿瘤标志物水平比较(±s)

注：与对照组比较，aP＜0.05；与乳腺良性疾病组相比较，bP＜0.05。

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2.2 三组受检者的血清肿瘤标志物水平比较乳腺癌组患者的血清CA153、CA125、CEA水平明显高于乳腺良性疾病组和对照组，乳腺良性疾病组患者的血清CA153和CA125水平明显高于对照组，差异均有统计学意义(P＜0.05)，见表2。

2.3 不同临床分期乳腺癌患者的血清microRNA-9-5p和肿瘤标志物水平比较Ⅲ～Ⅳ期乳腺癌患者的血清microRNA-9-5p、CA153和CA125水平明显高于Ⅰ期和Ⅱ期，Ⅱ期乳腺癌患者的血清microRNA-9-5p和CA153水平明显高于Ⅰ期，差异均有统计学意义(P＜0.05)，见表3。

2.4 血清microRNA-9-5p和肿瘤标志物与乳腺癌患者临床分期的相关性首先进行变量赋值，Ⅰ期=1，Ⅱ期=2，Ⅲ期=3，Ⅳ期=4。Pearson相关性分析显示，乳腺癌组患者的血清microRNA-9-5p和CA153水平与患者的临床分期具有显著的相关性(P＜0.05)，见表4。

表3 不同临床分期乳腺癌患者的血清microRNA-9-5p和肿瘤标志物水平比较(±s)

表3 不同临床分期乳腺癌患者的血清microRNA-9-5p和肿瘤标志物水平比较(±s)

注：与Ⅰ期乳腺癌患者比较，aP＜0.05；与Ⅱ期乳腺癌患者比较，bP＜0.05。

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表4 血清microRNA-9-5p和肿瘤标志物与乳腺癌患者临床分期的相关性

2.5 血清microRNA-9-5p和肿瘤标志物诊断乳腺癌的价值血清microRNA-9-5p诊断乳腺癌的AUC为0.735，血清CA153、CA125、CEA诊断乳腺癌的AUC依 次 为0.832、0.775和0.724；血 清microRNA-9-5p联合CA153、CA125、CEA诊断 乳 腺 癌的AUC为0.936，见图1和表5。

图1 血清microRNA-9-5p和肿瘤标志物诊断乳腺癌的ROC曲线

表5 血清microRNA-9-5和肿瘤标志物诊断乳腺癌的ROC特征

3 讨论

乳腺癌患者早期通常不表现明显症状，临床主要依赖影像学检查辅助血清学检测进行筛查和诊断，但对于早期乳腺癌的诊断仍存在一定的局限性[10]。microRNA-9-5p是一类具有多种调控作用的单链非编码miRNA，广泛分布于各种属动物，可以与靶mRNA的3'-UTR结合，调节细胞内的多条重要信号通路[11]。目前，microRNA-9-5p在乳腺癌中的调控作用仍存在争议，部分研究认为microRNA-9-5p可以靶向负调节Ecadherin的表达，促进肿瘤细胞的侵袭和迁移，推进肿瘤的恶性进展[12]。然而部分研究认为，microRNA-9-5p可以调节TUG1的表达，抑制MCF-7细胞的增殖，促进其凋亡[13]。本研究检测了乳腺癌患者血清中microRNA-9-5p水平变化，发现乳腺癌患者血清microRNA-9-5p、CA153、CA125和CEA水平明显高于乳腺良性疾病患者和健康人群。CA153、CA125和CEA均为临床常用的诊断乳腺癌的血清肿瘤标识物，在乳腺癌中存在异常高表达，常用于乳腺癌的诊断和早期筛查[14]，本研究与其基本类似，提示CA153、CA125和CEA均可用于乳腺癌的早期诊断。徐静等[15]的研究显示，乳腺癌患者血清microRNA-9-5p水平明显升高，对乳腺癌具有一定的诊断价值，本研究结果与其部分一致，提示血清microRNA-9-5p水平变化与乳腺癌的疾病进展有关，可能通过调节肿瘤相关信号通路表达，参与乳腺癌的发生发展，有望应用于临床诊断。

本研究中，血清microRNA-9-5p和CA153与乳腺癌患者的TNM分期具有显著的相关性，临床分期越严重，血清microRNA-9-5p和CA153水平越高。TNM分期是国际上通用的乳腺癌临床分期指南，可以指导乳腺癌患者临床诊疗工作的进行，评估患者的预后[16]，提示血清microRNA-9-5p水平与乳腺癌患者的预后有关。CUI等[17]的研究显示，食管鳞状细胞癌患者血浆中microRNA-9水平明显升高，可作为诊断和预测因子用于食管鳞状细胞癌的诊断和预后生存评估，提示血清microRNA-9-5p水平有望应用于乳腺癌患者的临床诊断和预后评估。本研究中，血清microRNA-9-5p与CA153、CA125和CEA均对乳腺癌具有一定的诊断价值，其中CA153的诊断价值明显高于microRNA-9-5p、CA125和CEA单独诊断，分析原因可能是由于血清microRNA-9-5p在不同分期乳腺癌患者中的水平差异较大，不适用于临床单独诊断。已有研究显示，肿瘤标志物的联合检测可以明显提高临床诊断的敏感度和特异性，提高诊断价值[18]。本研究分析了血清microRNA-9-5p联合传统血清肿瘤标志物对乳腺癌的诊断价值，发现血清microRNA-9-5p联合传统血清肿瘤标志物CA153、CA125、CEA诊断乳腺癌的AUC明显高于其单独诊断，提示临床可选择联合检测血清microRNA-9-5p和传统血清肿瘤标志物，提示乳腺癌患者的检出率。

综上所述，乳腺癌患者血清microRNA-9-5p、CA153、CA125和CEA水平明显高于乳腺良性疾病患者和健康人群，联合检测对乳腺癌具有较高的诊断价值，且血清microRNA-9-5p和CA153与乳腺癌患者的临床分期具有显著的相关性，提示临床可联合检测血清microRNA-9-5p和传统肿瘤标志物用于临床乳腺癌的诊断筛查和预后评估。本研究不足之处在于样本数量较少，且仅初步分析了乳腺癌患者血清microRNA-9-5p的水平变化，具体的作用机制尚不明确，有待于临床深入探索。