支气管哮喘病儿外周血单核细胞中LncRNA MEG3的表达及其与肺功能、免疫功能的相关性研究

李丽英，李海燕，陈海燕

作者单位：安阳市妇幼保健院儿科，河南 安阳455000

支气管哮喘是临床常见的一种气道慢性炎症性疾病，其发病与遗传、免疫等因素密切相关，在发病过程中有多种基因或细胞因子参与。长链非编码RNA（Long non-coding RNA，LncRNA））是一类转录本长度超过200nt 的RNA 分子的RNA，虽然不具备蛋白的编码功能，但能够在多层面实现对基因表达的调控。在支气管哮喘发病过程中，LncRNA能够通过调节炎症反应等从而参与支气管哮喘发生及发展过程。长链非编码RNA母系表达基因3（Long noncoding RNAmaternally expressed gene 3，LncRNA MEG3）具有多样的生物调节功能，对细胞的凋亡及增殖、淋巴细胞的分化及炎性介质的表达均具有调控作用，并且在恶性肿瘤、免疫系统疾病及心血管疾病的发生及进展过程中具有重要的作用。支气管哮喘的发病及进展与免疫功能异常、炎性介质的持续释放关系密切，推测LncRNA MEG3对免疫功能及炎性介质的调节作用可能在支气管哮喘的发病及进展中发挥作用，但目前LncRNA MEG3在小儿支气管哮喘的发病及进展中的作用尚未见相关的研究报道。因此本研究检测支气管哮喘病儿外周血单核细胞中LncRNAMEG3的表达并分析其与病儿肺功能、免疫功能的相关性，旨在探讨LncRNA MEG3在支气管哮喘发病中的作用及其机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2017年10月至2018年9月安阳市妇幼保健院收治的支气管哮喘病儿60例，纳入标准：（1）诊断符合中华医学会儿科学分会呼吸学组2016年发布的《儿童支气管哮喘诊断和防治指南》诊断标准，（2）支气管哮喘病儿近期1 周内未服用茶碱、糖皮质激素、支气管扩张剂等影响肺功能的药物，（3）病儿近亲属对研究内容知情同意。排除标准：合并先天性心脏病病儿；合并自身免疫性疾病病儿；既往恶性肿瘤病史。病儿入选后按病情分组，根据病儿发作时严重程度分为轻度组（轻度持续发作，20 例），中度组（中度持续发作，20例），重度组（重度持续发作，20 例）。同时选取同期体检的健康儿童40 例作为对照组。各组受试者年龄、性别比较差异无统计学意义（

P＞

0.05），具有可比性。病人或其近亲属知情同意，本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求。

表1 支气管哮喘病儿60例及健康儿童40例一般资料比较

1.2 肺功能检测

应用MS-IOS型肺功能检测仪（德国JAEGER 公司）检测各组受检儿童的肺功能指标，主要包括第1 秒用力呼气容积占预计值百分比（FEV1%），第1 秒用力呼气容积与用力肺活量比（FEV1/FVC）、最大呼气峰流速占预计值百分比（PEF%）。

1.3 指标检测

1.3.1

标本采集 清晨采集各组受检儿童空腹静脉血4 mL，血液样本分为两部分，一部分血液样本置于非抗凝试管中，室温放置2 h，4 ℃条件下1 200 r/min 离心15 min，吸取血清置于-80 ℃超低温冰箱保存。另一部分血液样本置于EDTA 抗凝试管中，采用Ficoll 密度梯度离心法提取外周血单核细胞，置于-80 ℃超低温冰箱保存。

1.3.2

LncRNA MEG3 水平检测 采用实时荧光定量聚合酶链反应（Quantitative Real-time PCR，qRTPCR）检测单核细胞LncRNAMEG3的表达水平，Trizol（美国Invitogen 公司）法提取单核细胞中的总RNA，Nanodrop2000c 超微量分光光度计检测RNA 浓度。MEG3 正 向 引 物5’-GGGCTTCTGGAATGAGCATG-3’，反向引物5’-TCTATGCCAG ATCCTGCCTG-3’；GAPDH 正 向 引 物5’-AACGGATTTGGTCGTATTG-3’，反向引物5’-GGAAGATGGTGATGGGATT-3’；引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。反转录体系（北京天根生化科技有限公司）：RNA 2 μL，10×RT Buffer 2 μL，dNTP 0.4 μL，Multiscripe RT 1 μL，10×Random Primer 2 μL，RNase-Free 双蒸水补足体系至20 μL；反应条件：25 ℃10 min，37 ℃60 min，95 ℃5 min，4 ℃保存。将总RNA反转录为cDNA，以cDNA为模板进行qRT-PCR扩增，反应体系（北京天根生化科技有限公司）：cDNA 2 μL，Real-Time Master Mix 10 μL，正反向引物各1 μL，RNase-Free 双蒸水补足体系至20 μL；反应条件：95 ℃2 min，95 ℃15 s，60 ℃1 min，72 ℃30 s（循环40次），置于ABI 7500型荧光定量PCR 仪（美国ABI 公司）检测，记录各组Ct 值，ΔCt（实验组）=Ct（实验组目标基因）-Ct（实验组内参基因），ΔCt（对照组）=Ct（对照组目标基因）-Ct（对照组内参），MEG3以GAPDH为内参，采用2法计算LncRNAMEG3的表达量。

1.3.3

免疫功能指标及炎性介质检测 应用IMMAGE800全自动特定蛋白分析仪（美国贝克曼库尔特公司）检测免疫球蛋白E（IgE）水平；应用全自动血细胞分析仪（北京宝灵曼阳光科技有限公司）检测嗜酸性粒细胞计数水平；采用酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）检测血清白细胞介素-4（interleukin-4，IL-4）、白细胞介素-17A（interleukin-17A，IL-17A）、γ干扰素（interferon γ，IFN-γ）、转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）水平，检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

2 结果

2.1 各组外周血单核细胞中LncRNA MEG3 的表达

重度组，中度组及轻度组LncRNA MEG3 表达水平高于对照组[（0.30±0.07）、（0.42±0.06）、（0.67±0.10）比（1.01±0.13）］（

P

＜0.05），重 度 组LncRNA MEG3 表达水平高于中度组及轻度组（

P

＜0.05）[（0.30±0.07）比（0.42±0.06）、（0.67±0.10）］，中度组LncRNA MEG3 表 达 水 平 高 于 轻 度 组（

P

＜0.05）[（0.42±0.06）比（0.67±0.10）］，。

2.2 各组受检者肺功能比较

重度组FEV1，FEV1/FVC及PEF低于中度组、轻度组及对照组（

P

＜0.05），中度组FEV1，FEV1/FVC 及PEF 低于轻度组及对照组（

P

＜0.05），轻度组FEV1，FEV1/FVC及PEF低于对照组（

P

＜0.05）。见表2。

表2 支气管哮喘病儿60例及健康儿童40例受检者肺功能比较/±s

2.3 各组受检者免疫功能指标比较

重度组，中度组及轻度组IgE、嗜酸性粒细胞计数水平、IL-4、IL-17A 水平高于对照组（

P

＜0.05），重度组IgE、嗜酸性粒细胞计数水平、IL-4、IL-17A水平高于中度组及轻度组（

P

＜0.05），中度组IgE、嗜酸性粒细胞计数水平、IL-4、IL-17A水平高于轻度组（

P

＜0.05）。重度组、中度组及轻度组IFN-γ、TGF-β 低于对照组（

P

＜0.05），重度组IFN-γ、TGF-β低于中度组及轻度组（

P

＜0.05），中度组IFN-γ、TGF-β低于轻度组（

P

＜0.05）。见表3。

表3 支气管哮喘病儿60例及健康儿童40例免疫功能指标比较/±s

2.4 支气管哮喘病儿LncRNA MEG3表达量与肺功能、免疫功能指标的相关性

采用Pearson相关分析支气管哮喘病儿MEG3表达量与肺功能的相关性，结果显示MEG3表达量与FEV1、FEV1/FVC、PEF%呈正相关（

P

＜0.05），采用Pearson 相关分析支气管哮喘病儿MEG3表达量与免疫功能指标的相关性，结果显示MEG3表达量与IgE、IL-4、IL-17A呈负相关（

P

＜0.05），而与IFN-γ、TGF-β呈正相关（

P

＜0.05）。见表4。

2.5 多因素综合分析

--

LncRNA MEG3 表达量与病情严重程度、肺功能、免疫功能的关联影响关系

建立多元线性回归模型，以观察组（支气管哮喘病儿）资料为样本，以LncRNA MEG3 表达量为应变量，以病情严重程度、肺功能（以FEV1/FVC 表征之）、免疫功能（以IgE 表征之）等3 个指标/因素为自变量（说明：样本量较少，肺功能及免疫功能，按临床专家建议，仅以代表性指标表征之）。回归过程采用最优子集法。默认建立

R

极大选择模型，以进行自变量的选择和剔除。回归结果：最优子集即全子集，3 个变量均被保留入回归方程（P＜0.05）。提示：病情严重程度、肺功能、免疫功能与LncRNA MEG3表达量有密切的关联影响关系。见表5。

3 讨论

支气管哮喘主要临床表现为气道慢性炎症与气道高反应性，其发生过程与遗传、表观遗传学因素等有关，LncRNA可调控相关基因表达从而参与支气管哮喘等多种疾病发生过程，还可作为疾病早期筛选的分子标志物。因而本研究积极探寻新型LncRNA并分析其与支气管哮喘病儿肺功能、免疫功能的相关性，为哮喘的诊断提供新的分子标志物。

LncRNAMEG3是在组织中广泛表达的非编码长链RNA，虽然不具备蛋白编码功能，但是其能够多种途径实现对转录及转录后过程进行调控，其最早被发现在恶性肿瘤中低表达，并且其表达降低的程度与肿瘤的侵袭性及进展有关。在近年的研究中发现，LncRNA MEG3对免疫细胞及炎性介质的释放具有调控作用。如在高糖诱导的视网膜上皮细胞中呈低表达，上调MEG3表达可抑制高糖诱导的视网膜上皮细胞炎症及细胞凋亡。有报道指出LncRNAMEG3可参与多种炎性疾病发生过程。在本研究中亦发现，支气管哮喘病儿单核细胞中LncRNAMEG3的表达水平降低，并且其降低的程度与病情相关，病情越重的病儿LncRNAMEG3下降的越明显，提示在小儿支气管哮喘的进展中，LncRNAMEG3发挥了调控作用。

支气管哮喘的发病与多因素有关，其中免疫功能异常及炎性介质的释放具有重要的作用，在支气管哮喘的发病过程中，细胞免疫及体液免疫均处于失衡状态，加之肥大细胞、粒细胞等炎性细胞的聚集及炎性介质的释放，使气道处于慢性炎症状态，导致气道的高反应性，在外来抗原的刺激下，诱发气道的痉挛，导致支气管哮喘的发作[17］。本研究显示，IgE、嗜酸性粒细胞计数水平、IL-4、IL-17A 水平显著升高，IFN-γ、TGF-β 水平显著降低，呼吸道是IgE 表达的部位之一，由浆细胞产生，能够诱发Ⅰ型变态反应，诱发支气管哮喘的发生。在支气管哮喘的发作过程中，辅助型T 细胞1（Th1）与辅助型T 细胞2（Th2）细胞分泌水平失衡哮喘进展的重要原因[18］。相关报道指出IFN-γ 是Th1 细胞的主要效应细胞因子，IL-4 是Th2 细胞的主要效应细胞因子，IL-17A 是辅助型T细胞17（Th17）的主要效应细胞因子，TGF-β是调节性T细胞（Treg）的主要效应细胞因子，研究表明Th1、Th2、Th17、Treg 细胞介导的免疫反应与多种炎症性疾病发生及发展过程密切相关[19］。IL-4、IL-17A 及IFN-γ 水平的变化，提示在支气管哮喘儿童，Th1/Th2 免疫飘逸，导致其下游的炎性介质的表达异常，参与支气管哮喘的进展。而TGF-β 能够诱导Th0细胞的分化方向，对其下游的炎性介质进行调控，进而参与支气管哮喘的发病及进展。

表4 支气管哮喘60例LncRNA MEG3表达量与肺功能、免疫功能指标的相关性

表5 支气管哮喘60例病情严重程度、肺功能、免疫功能与LncRNA MEG3表达量的多元线性回归结果

在进一步的研究中发现，在小儿支气管哮喘病儿，LncRNAMEG3的表达水平与IgE、IL-4、IL-17A呈负相关，而与IFN-γ、TGF-β 呈正相关，与FEV1，FEV1/FVC 及PEF 呈现正相关，病情严重程度、肺功能、免疫功能与LncRNA MEG3 表达量有密切的关联影响关系。提示LncRNAMEG3 能够反应病儿肺部的功能状态，其可能通过对免疫因子及炎性介质的释放的调控而参与支气管哮喘的发生及进展。

综上所述，MEG3在支气管哮喘病儿外周血单核细胞中呈低表达，并可能参与哮喘发生及发展过程，可作为早期诊断哮喘及监控疾病进展的分子标志物，对哮喘病儿预后的预判具有一定作用，其可能通过对免疫因子及炎性介质的调节发挥作用。但LncRNAMEG3在支气管哮喘发生及发展过程中的作用机制尚未可知，还需扩大样本量进行分子生物学探究。