不同咽拭子取样肺炎支原体DNA检测对支原体肺炎诊断价值研究

丁彩云，王梦瑾，孙立清

作者单位：蚌埠市第一人民医院（蚌埠市儿童医院）小儿呼吸内科，安徽 蚌埠233000

支原体肺炎也称为冷凝集阳性肺炎，该病主要由支原体感染所致，据相关调查显示支原体肺炎占儿童获得性肺炎的10%～40%，常表现为发热及咳嗽，多数病儿精神状况良好，无气促及呼吸困难，在重症时可出现呼吸困难，甚至引起灶性肺不张、肺实变及肺气肿。因支原体肺炎与其他肺部感染鉴别难度大，容易出现误诊而延误治疗时机，目前对于支原体肺炎诊断的金标准仍是支原体培养，该方法培养要求高且耗时较长，在临床实际实施过程难度较大。因此临床上多采用血清特异性抗体检测，目前主要以MP-IgM阳性转化或抗体滴度上升4倍以上则诊断为MP感染，但MP-IgM检测有一定的滞后性，在发病1周后才可检测且假阴性率较高，因而难以实现对支原体肺炎的早期诊断。近期有研究发现呼吸道分泌物PCR 检测可用于支原体肺炎的早期诊断，目前关于咽拭子取样肺炎支原体DNA检测对支原体感染性肺炎病儿诊断方面的研究已有相关报道，但仍存在一定的假阳性与假阴性的结果，分析原因可能与取样过程操作有关。因此本研究旨在通过优化咽拭子取样过程以提高咽拭子取样肺炎支原体DNA检测对支原体感染性肺炎病儿诊断效能。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2017年2月至2019年6月在蚌埠市第一人民医院（蚌埠市儿童医院）接受治疗的疑似肺炎支原体感染住院病儿174 例进行研究。纳入标准：①病儿经临床特征及检查疑似为支原体肺炎，参照《儿童肺炎支原体肺炎诊治专家共识（2015年版）》制定支原体肺炎的疑似表现：以咳嗽、发热为主要表现，部分伴有畏寒、头痛胸闷等症状；白细胞计数正常或偏低，在重症病儿中C反应蛋白可明显增高；肺部CT 检查表现为磨玻璃影、结节状或小斑片状影，同时可有支气管壁增厚、支气管充气征及支气管扩张等表现；②病儿神志清醒，智力正常，可配合进行相关检查；③病儿家属已获知情同意。排除标准：①对标本采集过程使用药物过敏者；②不愿意配合进行采样者；③既往支原体感染者；④患有自身免疫缺陷性疾病的病人。本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求，病儿近亲属对研究方案签署知情同意书。

1.2 方法

所有病儿入院后均由同一组护士采用2种咽拭子采集方式对气道分泌物进行采集，采集前要求病儿禁食、禁饮4 h 以上。具体操作如下：（1）常规采集：直接以无菌咽拭子在病儿喉部迅速捻转一周，提取咽拭子标本，加入1.5 mL 灭菌生理盐水振荡2～3 次后混匀，吸取1 mL 生理盐水至离心管中，以12 000 r/min转速离心5 min后弃去上清液，在沉淀中加入50 μL DNA 提取液，在100 ℃恒温处理10 min 后以12 000 r/min 转速离心5 min，取2 μL 进行PCR 扩增，采用新加坡生产的ABI7500 型荧光定量PCR仪。试剂盒是中山大学达安基因股份有限公司、PCR荧光探针法，具体操作按仪器及试剂盒操作说明进行。（2）改良咽拭子取样：对病儿取样前先以吸入用乙酰半胱氨酸溶液（意大利ZAMBON公司，批准文号H20150548，批次20190427）3 mL 进行雾化10 min，再行咽拭子取样，取样方式及检测方法同常规采集。（3）金标准：参照诸福棠《实用儿科学》第7版中对支原体肺炎的相关诊断，根据临床症状、胸片及入院次日及入院后7～10 d，抽取病人空腹外周静脉血3 mL，分别进行MP-IgM 检测，双份血清抗体滴度检测呈4倍以上增长则确诊为支原体肺炎。

2 结果

2.1 一般情况

174 例病儿男89 例，女85 例；年龄范围1～13岁，年龄（7.53±1.47）岁；病程范围3～21 d，病程（14.09±4.15）d，其中37例（21.26%）经金标准诊断确诊为支原体感染性肺炎。

2.2 常规咽拭子取样肺炎支原体DNA 检测对支原体感染性肺炎诊断效能分析

常规咽拭子取样肺炎支原体DNA 检测与金标准诊断结果一致性尚可（Kappa=0.526，

P＜

0.001），常规咽拭子取样肺炎支原体DNA 检测对支原体感染性肺炎诊断的灵敏度、特异度、准确度、阳性预测值、阴性预测值分别为78.38%（29/37）、82.48%（113/137）、81.61%（142/174）、54.72%（29/53）、93.39%（113/121）。

2.3 改良咽拭子取样肺炎支原体DNA 检测对支原体感染性肺炎诊断效能分析

改良咽拭子取样肺炎支原体DNA 检测与金标准诊断结果一致性良好（Kappa=0.781，

P

＜0.001），改良咽拭子取样肺炎支原体DNA 检测对支原体感染性肺炎诊断的灵敏度、特异度、准确度、阳性预测值、阴性预测值分别为94.59%（35/37）、91.24%（125/137）、91.95%（160/174）、74.47%（35/47）、98.43%（125/127）。

2.4 不同咽拭子取样方式对支原体感染性肺炎诊断效能对比

检验结果表明，改良咽拭子取样肺炎支原体DNA 检测对支原体感染性肺炎诊断效能灵敏度、特异度、准确度、阳性预测值均高于常规咽拭子取样（

P

＜0.05）。见表1。

表1 不同咽拭子取样方式对支原体感染性肺炎诊断效能对比

3 讨论

相关调查数据显示每隔5年左右支原体感染性肺炎可出现一次地域性流行，在儿童密集区流行较为严重，在非流行年间支原体约占小儿肺炎病原的10%～20%，流行年份则高达30%以上。本研究174例疑似病例中37例（21.26%）经金标准诊断确诊为支原体感染性肺炎，与上述研究结果相当。肺炎支原体可经飞沫传播而引起儿童呼吸道感染，肺炎支原体感染性肺炎临床表现不一，病情或轻或重、病程较长、容易反复发作，还可引起多种肺外并发症，严重者可引起病人死亡。因此对该病早期快速诊断，及时使用大环内脂类抗生素可有效缩短病程，减少并发症的发生。对于该病的诊断传统以分离培养及抗体检测为金标准，但抗体检测需通过2次比较上升4倍以上才可确诊，导致诊断出现滞后性而延误病情，而痰培养结果判定则更长，需要3～4周的时间，同时还受取样的影响，假阴性率较高，不利于病人的治疗。

近年来PCR技术在病原体检测方面得到了广泛的应用，其敏感性高，特异性强的优势是过去其他检测技术所无法比拟的，特别是荧光定量PCR技术的发展，可通过扩增基因片段而对病原体进行诊断，该方法操作难度小，敏感度高，可实现对支原体感染性肺炎的早期诊断，但受取样方式的影响可能导致一定假阴性率的出现。有研究者曾对肺泡灌洗液、咽拭子等几种取样方式进行分析结果显示：肺泡灌洗液取样检测方式诊断效能最佳，但该取样方式需采用纤维支气管镜进行肺泡灌洗，对病儿有一定的创伤性，加上操作过程中需要病儿的配合，实施难度较大，因此未在临床上大面积推广使用。目前临床仍以咽拭子取样为主，该取样方式操作简便，对病儿无创伤，病儿及其家属接受程度更高。加上从理论上讲，咽部为肺炎支原体最早感染繁殖部位，可在发病早期采集到病原体。但因支原体感染可致病人咽部分泌物增加且分泌物较为黏稠，在咽拭子取样时容易因取样不均而造成假阴性结果的出现，因此有必要对常规的咽拭子取样方式进行改良，以降低因取样不当而引起的假阴性结果。本研究结果中两种取样方式均与金标准具有较高的一致性，但改良咽拭子取样方式灵敏度、特异度、准确度、阳性预测值、阴性预测值更高，可有效降低误诊率。乙酰半胱氨酸为临床上常用的支原体肺炎等呼吸道疾病治疗药物，为半胱氨酸N-乙酰化衍生物，其结构中含有一自由的亲核基团-巯基（-SH）可使黏痰中的酸性糖蛋白多肽二硫键断裂，而达到分解黏液蛋白复合物使痰液黏稠度降低的作用。同时该药物还可裂解脓痰DNA，使痰液迅速被溶解而加速排出，使咽拭子所取样品更为均匀，减少脓痰对取样的影响，使准确率明显上升。加上乙酰半胱氨酸抗氧化能力较强，可通过多种途径参与氮氧化物的抗菌作用，破坏细菌蛋白铁硫集群而催化毒性氧化反应，同时该药物提供的一氧化氮还可扰乱参与DNA复制的锌蛋白及酪氨酰激酶反应而抑制DNA复制，在提高检出率的同时还可缓解病情。

综上所述，咽拭子取样肺炎支原体DNA 检测对支原体感染性肺炎病儿具有较高的诊断价值，采取改良咽拭子取样可有效提高诊断灵敏度、特异度、准确度及阳性预测值。