溴苯基姜黄素对胆管癌细胞凋亡、迁移和侵袭的影响及机制研究

赵冀安 马艳荣 聂文佳 董梁 刘文聪 谷敬锋

摘 要 目的：研究溴苯基姜黄素（GL63）对人胆管癌RBE细胞凋亡、迁移和侵袭的影响，并基于Janus激酶（JAK）/信号转导及转录激活因子（STAT）信号通路探讨其作用机制。方法：采用MTT法检测不同浓度GL63[0（空白对照，下同）、1.25、2.5、5、10、20、40 μmol/L]作用48 h对RBE细胞增殖的影响，并计算其半数抑制浓度（IC50）;采用结晶紫染色法检测不同浓度GL63（0、5、10、20 μmol/L）作用48 h对细胞集落形成的影响;分别采用流式细胞术、Hoechst 33342染色法、细胞划痕实验、Transwell小室侵袭实验检测不同浓度GL63（0、5、10、20 μmol/L）作用24 h对细胞周期分布、凋亡情况以及细胞迁移和侵袭能力的影响;采用Western blotting法检测不同浓度GL63（0、5、10、20 μmol/L）作用24 h对细胞中JAK2/STAT3信号通路肿瘤相关蛋白表达的影响。结果：不同浓度GL63组（1.25～40 μmol/L）RBE细胞的增殖抑制率均较空白对照组显著升高（P<0.01），并呈剂量依赖趋势;其IC50为（8.46±1.30） μmol/L。与空白对照组比较，不同浓度GL63组（5、10、20 μmol/L）RBE细胞的集落形成抑制率均显著降低（P<0.01）;G0/G1期细胞占比均显著升高，S期細胞占比均显著降低（P<0.01）;细胞凋亡率均显著升高（P<0.01），且细胞核呈浓染致密的固缩形态并可见凋亡小体;细胞迁移愈合率均显著降低（P<0.01），穿过基底膜的侵袭细胞数均显著减少（P<0.01）;细胞中磷酸化JAK2、磷酸化STAT3、B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）、基质金属蛋白酶2（MMP-2）、MMP-9、前体胱天蛋白酶9（Pro-caspase-9）、Pro-caspase-3蛋白表达水平均显著降低，Bcl-2相关x蛋白（Bax）、细胞色素C、裂解Caspase-9（Cleaved-caspase-9）、Cleaved-caspase-3蛋白表达水平均显著升高（P<0.01）。结论：GL63能通过抑制JAK2/STAT3信号通路来实现对人胆管癌RBE细胞增殖、迁移和侵袭的抑制并诱导其发生凋亡。

关键词 溴苯基姜黄素;胆管癌;RBE细胞;Janus激酶2/信号转导及转录激活因子3信号通路;迁移;侵袭;凋亡

ABSTRACT   OBJECTIVE： To study the effects of bromophenylcurcumin（GL63） on the apoptosis， migration and invasion of human cholangiocarcinoma RBE cells， and to investigate its mechanism based on JAK/STAT signaling pathway. METHODS： MTT assay was used to detect the effects of different concentrations of GL63 [0（blank control， similarly hereinafter）， 1.25， 2.5， 5， 10， 20， 40 μmol/L] on the proliferation of RBE cells after 48 h treatment; the IC50 was calculated. The effects of different concentrations of GL63 （0， 5， 10， 20 μmol/L） on colony formation were detected by crystal violet staining after 48 h treatment. Flow cytometry， Hoechst 33342 staining， cell scratch test and Transwell chamber invasion test were used to detect the effects of different concentrations of GL63 （0， 5， 10， 20 μmol/L） on cell cycle distribution， apoptosis， migration and invasion ability after 24 h treatment. Western blotting assay was adopted to detect the effects of different concentration of GL63 （0， 5， 10， 20 μmol/L） on the expression of JAK2/STAT3 signal pathway associated proteins. RESULTS： The proliferation inhibition rates of RBE cells in different concentrations of GL63 groups （1.25-40 μmol/L） were significantly increased， compared with blank control group  （P<0.01）， and showed a dose-dependent trend， with IC50 of （8.46±1.30） μmol/L. Compared with blank control group， inhibition rates of RBE cell colony formation were significantly decreased in different concentrations （5， 10， 20  μmol/L） of GL63 groups （P<0.01）. The percentage of RBE cells at G0/G1 phase increased significantly， while that at S phase decreased significantly （P<0.01）. The apoptotic rate increased significantly （P<0.01）， and the nucleus showed dense pyknosis and apoptotic bodies. The rate of cell migration and healing was significantly decreased （P<0.01）， and the number of invasive cells through basement membrane was significantly decreased （P<0.01）. The protein expression of p-JAK2， p-STAT3， Bcl-2， MMP-2， MMP-9， Pro-caspase-9 and Pro-caspase-3 were down-regulated significantly while the expression of Bax， Cyt-c， Cleaved-caspase-9 and Cleaved-caspase-3 were up-regulated significantly （P<0.01）. CONCLUSIONS： GL63 may inhibit the proliferation，migration and invasion of RBE cells and promote its apoptosis by inhibiting JAK2/STAT3 signal pathway.

KEYWORDS   Bromophenylcurcumin; Cholangiocarcinoma; RBE cell; JAK2/STAT3 signal pathway; Migration; Invasion; Apoptosis

胆管癌是一种来源于胆管上皮细胞的高度侵袭性恶性肿瘤，其发病率和病死率均呈上升趋势[1]。胆管癌的恶性程度高、发病隐匿、诊治困难，虽然外科根治性切除术为目前临床治疗胆管癌的首选，但患者术后预后较差[2]，所以寻找抑制胆管癌细胞增殖、侵袭的有效药物，是目前临床亟待解决的主要问题。姜黄素是从姜科植物中提取的一种植物多酚类物质，具有抗炎、抗氧化和抗肿瘤等多种生物学活性，但是临床研究显示由于其生理条件下的不稳定性，使得该成分的生物活性和药动学行为均不理想，从而造成其在抗癌治疗方面的应用受限[3-4]。本研究选用了一种新的姜黄素衍生物——溴苯基姜黄素（GL63）为对象。与姜黄素相比，GL63的水溶性和稳定性大为提高，并具有较高的细胞通透性，体现出较高的生物利用度和较强的药理活性[5]。研究发现，Janus激酶（JAK）/信号转导及转录激活因子（STAT）信号通路与胆管癌的发生密切相关[6]。因此，本课题组通过体外研究观察GL63作用于人胆管癌细胞后对细胞凋亡、迁移和侵袭行为的影响，同时通过JAK2/STAT3信号通路肿瘤相关蛋白探索其可能机制，以期为胆管癌的治疗提供新的思路与药物选择。

1 材料

1.1 主要仪器

本研究涉及的主要仪器包括：NU-400-400E型超净工作台（美国ShelLab公司），FORM 361型细胞培养箱（美国Thermo Electronic公司），TGL16型高速离心机（长沙英泰仪器有限公司），TC20型细胞计数仪、xMark型酶标仪（美国Bio-Rad公司），AE31型倒置相差显微镜及照相系统（德国Motic公司），CKX31型倒置荧光显微镜（日本Olympus公司），D2060R型流式细胞仪（美国Beckman Coulter公司），HH-2型数显恒温水浴锅（常州亿通分析仪器制造有限公司），DYCZ-24DN型垂直电泳仪（北京市六一仪器厂），BOX XR型凝胶成像分析系统（英国Syngene公司），FA1004型电子天平（上海越平科学仪器有限公司）。

1.2 主要药品和试剂

姜黄素原料药（批号78246，纯度99.5%）、RPMI  1640培养基均购自美国Sigma公司;GL63原料药（纯度>99.5%）由河北科技大学化学与制药工程学院刘守信教授合成并鉴定;膜联蛋白Ⅴ-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶（Annexin Ⅴ-FITC/PI）细胞凋亡检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司;兔抗人JAK2、磷酸化JAK2（p-JAK2）、STAT3、磷酸化STAT3（p-STAT3）、B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2相关x蛋白（Bax）、基质金属蛋白酶2（MMP-2）、MMP-9、细胞色素C（Cyt-c）、前体胱天蛋白酶9（Pro-caspase-9）、裂解Caspase-9（Cleaved-caspase-9）、Pro-caspase-3、Cleaved-caspase-3、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）多克隆抗体（批号分别为ab39636、ab195055、ab137803、ab131103、ab59348、ab53154、ab97779、ab38898、ab90529、ab69541、ab2324、ab90437、ab49822、ab37168）和MTT试剂均购自英国Abcam公司;辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗（批号sc-2025）购自美国Santa Cruz公司;胎牛血清购自美国Gibco公司;基质胶购自美国BD公司;细胞总蛋白质抽提试剂、蛋白定量试剂盒、结晶紫试液均购自北京索莱宝科技有限公司;ECL发光检测试剂盒购自美国Millipore公司;Hoechst 33342蓝色荧光染料购自美国BioVision公司;0.25%胰酶购自武汉尚恩生物技术有限公司;其余试剂为分析纯，水为蒸馏水。

1.3 细胞

人胆管癌RBE细胞株来自中国科学院北京细胞生物研究所。

2 方法

2.1 GL63对RBE细胞增殖的影响考察

采用MTT法进行检测。取RBE细胞，以含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基（以下简称“完全培养基”）于5%CO2、37 ℃（以下培养条件相同）的培养箱中培养。当培养瓶底部贴壁细胞达90%以上时，用0.25%胰酶消化后进行传代。将对数生长期细胞用培养基调整为1×105个/mL，按100 μL/孔接种于96孔板中，置于培养箱中继续培养12 h待细胞贴壁后，弃去培养基。将细胞分组并分别加入含有不同浓度GL63[终浓度均为0（空白对照，下同）、1.25、2.5、5、10、20、40 μmol/L;剂量根据文献[3-5]及本课题组前期预试验结果设置]的RPMI 1640培养基（含0.1%二甲基亚砜），每组设3个复孔。培养48 h后，每孔加入MTT溶液（5 mg/mL）20 μL，避光继续培养4 h。培养完畢后，用酶标仪于450 nm波长下检测各孔的光密度（OD）值并计算细胞增殖抑制率：增殖抑制率=（空白对照组OD值-给药组OD值）/空白对照组OD值×100%;采用SPSS 13.0软件根据药物浓度和细胞增殖抑制率计算GL63的半数抑制浓度（IC50）。试验重复3次。

2.2 GL63对RBE细胞集落形成的影响考察

采用结晶紫法进行检测。将对数生长期RBE细胞以0.25%胰酶消化后，以500个/孔接种于6孔板中，培养待其贴壁后，弃去培养基。将细胞分组并分别加入含不同浓度GL63（0、5、10、20 μmol/L，剂量根据“2.1”项MTT法试验和本课题组前期预试验结果设置，下同）的完全培养基继续培养48 h后取出，持续替换新鲜的完全培养基培养14 d使细胞形成集落。培养结束后，细胞用磷酸盐缓冲液（PBS，pH=7.4）洗涤，并用4%多聚甲醛溶液固定20 min，再以1%结晶紫试液染色。在倒置相差显微镜下观察细胞增殖形成的集落，对其进行计数并计算集落形成抑制率：集落形成抑制率（%）=给药组集落均数/空白对照组集落均数×100%。试验重复3次。

2.3 GL63对RBE细胞周期分布和凋亡的影响考察

采用流式细胞术对细胞周期分布和凋亡情况进行检测。将对数生长期RBE细胞以0.25%胰酶消化后，以1×105个/孔接种于6孔板中，培养24 h待细胞贴壁后，弃去培养基。将细胞分组并分别加入含不同浓度GL63（0、5、10、20 μmol/L）的完全培养基，继续培养24 h，然后收集、洗涤细胞。在细胞中先后加入Annexin Ⅴ-FITC、PI试剂各5 μL，混匀，于室温下避光反应15 min后，用流式细胞仪进行细胞周期和细胞凋亡检测。试验重复3次。

另采用Hoechst 33342染色法对细胞凋亡情况进行检测。将对数生长期RBE细胞以0.25%胰酶消化后，按1×105个/孔接种于6孔板中，盖上盖玻片培养24 h使细胞贴壁后，弃去培养基。将细胞分组并分别加入含不同浓度GL63（0、5、10、20 μmol/L）的完全培养基，继续培养48 h。吸弃上清液，用PBS清洗2次后，每孔加入固定液固定10 min;以PBS漂洗3次后，滴加Hoechst 33342蓝色荧光染料100 μL，室温放置10 min;用PBS清洗3次再晾干后，以340 nm波长的紫外光激发，在倒置荧光显微镜下观察并拍照。

2.4 GL63对RBE细胞迁移的影响考察

采用划痕实验进行检测。将对数生长期RBE细胞以0.25%胰酶消化后，按1×105个/孔接种于6孔板中，培养24 h待其融合至90%，采用尖端粗细相同的无菌枪头垂直划线;用PBS清洗除去悬浮的细胞后，将余下细胞分组并分别加入含不同浓度GL63（0、5、10、20 μmol/L）的完全培养基，继续培养24 h。然后，于倒置相差显微镜下观察划痕距离，每个样品随机选取5个视野，分别测量并计算初始划痕时和加药培养完毕后的划痕距离的差值（即细胞迁移距离）并取平均值。计算细胞迁移愈合率：迁移愈合率=细胞迁移距离平均值/初始划痕距离均值×100%。实验重复3次。

2.5 GL63对RBE细胞侵袭的影响考察

采用Transwell小室侵袭实验进行检测。将对数生长期RBE细胞以0.25%胰酶消化后，按1.5×105个/mL接种于Transwell小室上室（铺有基质胶，加入菌液体积为0.5 mL），下室加入等体积完全培养基，然后上下室均分别加入含不同浓度GL63（0、5、10、20 μmol/L）的完全培养基，继续培养24 h。培养结束后，用棉签擦去上室漂浮的细胞，再用4%多聚甲醛溶液固定细胞15 min，再浸入结晶紫试液中染色20 min，在倒置相差显微镜（100倍）下随机选取5个视野进行拍照并对细胞进行计数，取平均值。实验重复3次。

2.6 GL63对RBE细胞中JAK2/STAT3信号通路肿瘤相关蛋白表达的影响考察

采用Western blotting法进行检测。将对数生长期RBE细胞按照“2.3”项下方法消化、接种、培养，分别加入含不同浓度GL63（0、5、10、20 μmol/L）的完全培养基，继续培养24 h;弃去培养液，加入蛋白裂解液冰浴裂解25 min后，收集细胞裂解液，于4 ℃下以15 000 r/min离心30 min，收集上清液，采用BCA法测定蛋白浓度。上清液经蛋白上样缓冲液稀释后，于100 ℃下变性5 min。取变性后的蛋白适量，进行12%聚丙烯酰胺凝胶电泳，随后转移至PVDF膜上;用5%脱脂牛奶封闭后，加入JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、Bcl-2、Bax、MMP-2、MMP-9、Cyt-c、Pro-caspase-9、Cleaved-caspase-9、Pro-caspase-3、Cleaved-caspase-3和GAPDH一抗（稀释度均为1 ∶ 1 000），4 ℃下孵育过夜;以TBST缓冲液洗膜，加入二抗（稀释度为1 ∶ 500），室温下孵育2 h;以TBST缓冲液洗膜经ECL化学发光试剂处理后，使用凝胶成像分析系统采集图像。采用Image J 5.0软件分析相应目标蛋白条带与内参GAPDH条带的灰度值之比，用来表示目标蛋白的表达水平。试验重复3次。

2.7 统计学方法

采用SPSS 19.0软件对数据进行统计分析。计量资料以x±s表示，多组间数据比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 GL63对RBE细胞增殖的影响

结果显示，与空白对照组比较，经不同浓度GL63（1.25、2.5、5、10、20、40 μmol/L）作用48 h后，细胞的增殖抑制率均显著升高（P<0.01），分别为（6.58±1.21）%、（15.28±1.64）%、（33.66±1.92）%、（52.53±2.16）%、（76.25±2.63）%、（92.28±3.67）%，且這一抑制作用有随着药物浓度升高而逐渐升高的趋势，详见图1。经计算，GL63对RBE细胞的IC50为（8.46±1.30） μmol/L。

3.2 GL63对RBE细胞集落形成的影响

结果显示，与空白对照组比较，不同浓度GL63组（5、10、20 μmol/L）细胞的集落密度均有所减少，其集落抑制率分别为（64.88±3.45）%、（34.70±2.57）%、（15.10±1.78）%，较空白对照组（100%）均显著降低（P<0.01），且有随着药物浓度升高而逐渐降低的趋势，详见图2。

3.3 GL63对RBE细胞周期的影响

结果显示，与空白对照组比较，不同浓度GL63组（5、10、20 μmol/L）G0/G1期细胞占比均显著升高，S期细胞占比均显著降低（P<0.01），且均有随着药物浓度升高而升高/降低更明显的趋势，详见图3、表1。

3.4 GL63对RBE细胞凋亡的影响

流式细胞术检测结果显示，与空白对照组比较，不同浓度GL63组（5、10、20 μmol/L）细胞凋亡率均显著升高（P<0.01），且有随着药物浓度升高而升高的趋势，详见图4、表1。

Hoechst 33342染色法结果显示，空白对照组细胞核呈现弥散均匀的低强度蓝色荧光，细胞核完整且染色均匀。不同浓度GL63组（5、10、20 μmol/L）均可见致密浓染的凋亡细胞，表现为核染色质的固缩浓集、破裂、蓝色荧光强度增大且不均匀的典型凋亡现象，并可见凋亡小体;其凋亡率均较空白对照组显著升高（P<0.01），且有随着药物浓度升高而升高的趋势，详见图5、表1。

3.5 GL63对RBE细胞迁移和侵袭能力的影响

划痕实验结果显示，与空白对照组比较，不同浓度GL63组（5、10、20 μmol/L）细胞的横向迁移距离均有缩短，迁移愈合率显著降低（P<0.01），且有随着药物浓度升高而降低的趋势，详见图6、表2。Transwell小室侵袭实验结果显示，与空白对照组比较，不同浓度GL63组（5、10、20 μmol/L）穿过基底膜的侵袭细胞数均显著减少（P<0.01），且有随着药物浓度升高而减少的趋势，详见图7、表2。

3.6 GL63对RBE细胞中JAK2/STAT3信号通路肿瘤相关蛋白表达的影响

结果显示，与空白对照组比较，不同浓度GL63组（5、10、20 μmol/L）细胞中p-JAK2、p-STAT3、Bcl-2、MMP-2、MMP-9、Pro-caspase-9、Pro-caspase-3蛋白表达水平均显著降低，Bax、Cyt-c、Cleaved-caspase-9、Cleaved- caspase-3蛋白表达水平均显著升高（P<0.01），且均有随着药物浓度升高而降低/升高的趋势;JAK2、STAT3蛋白表达水平在各组之间差异均无统计学意义（P>0.05），详见图8、图9、表3、表4。

4 讨论

据研究报道，姜黄素在体外可阻滞胆管细胞系的细胞周期，发挥细胞毒性作用，可抗细胞增殖并诱导其凋亡[7]。但由于其结构不稳定使应用受限，因此有研究者通过删除其结构中活性β-二酮部分，设计并合成了姜黄素的单羰基类似物GL63，即（1E，4E）-1，5-双（2-溴苯基）戊-1，4-二烯-3-酮[8]。研究表明，GL63不仅在体外具有较强的稳定性和抗肿瘤活性，而且在体内也表现出比姜黄素更理想的药动学行为[9]。还有研究表明，GL63对人肝癌HepG2细胞和人鼻咽癌CNE2细胞的毒性作用是基于内质网应激途径而诱导的细胞周期停滞;而且GL63和姜黄素均未诱导正常肝细胞凋亡，这表明GL63没有明显的毒性，与姜黄素类似[10-11]。本研究表明，GL63抑制人胆管癌RBE细胞增殖和集落形成的能力有随着药物浓度升高而增强的趋势;GL63抑制RBE细胞增殖的IC50为（8.46±1.30） μmol/L，与姜黄素IC50（21.5 μmol/L）[4]相比明显降低。这些结果表明，姜黄素衍生化合物GL63有望被开发为有效、安全的新型抗肿瘤药物。

细胞周期停滞和形态变化是肿瘤细胞增殖受到抑制的主要特征[12]。本研究发现，与空白对照组比较，随着GL63作用浓度的升高，RBE细胞在G0/G1期的占比显著升高、S期占比显著降低;细胞核染色质表现为固缩浓集、破裂、蓝色荧光强度增强且不均匀的典型凋亡现象;细胞凋亡率也显著升高。这也进一步证实了GL63可抑制RBE细胞的增殖。

JAK2/STAT3信号通路的激活与肿瘤的发生发展过程紧密相关，其能促进肿瘤细胞增殖、抑制其凋亡，可调节涉及各种生理功能的靶蛋白的表达，包括抗凋亡蛋白（Bcl?xl、Bcl?2）、促凋亡蛋白（Bax）和线粒体凋亡途径相关蛋白（Cyt-c、Caspase-3、Caspase-9）[13]。重要的是，激活的JAK2/STAT3信号通路已被广泛验证为治疗人类肿瘤的新型分子靶标[14]。本研究基于JAK2/STAT3信号通路肿瘤相关蛋白考察了GL63对人胆管癌RBE细胞的抑制作用，并证实GL63可有效抑制JAK2和STAT3蛋白的活化（即磷酸化），从而抑制细胞增殖并诱导细胞凋亡;同时认为，GL63对RBE细胞的增殖具有抑制作用，其机制可能是通过抑制JAK2/STAT3信号通路来介导的。

肿瘤患者预后较差的重要原因是肿瘤细胞发生侵袭和远处转移，所以降低胆管癌细胞的迁移、侵袭能力是预防其转移的有效手段。MMP被公认为是能够在肿瘤细胞侵袭过程中破坏组织屏障细胞外基质的蛋白内切酶[15]。MMP-2和MMP-9表达水平的升高提示肿瘤细胞侵袭能力增强[16]，因此抑制MMP蛋白的表达被认为是预防癌症转移的早期靶点[17-18]。本研究通过划痕实验和Transwell小室侵袭实验发现，GL63可以有效地抑制RBE细胞迁移和侵袭。与空白对照组比较，经不同浓度GL63处理后，RBE细胞中MMP-2和MMP-9蛋白的表达水平均显著降低，且有随着药物浓度升高而降低的趋势。这提示GL63可能通过抑制MMP-2和MMP-9的表达从而抑制RBE细胞的迁移和侵袭。

已有研究表明，不同药物对JAK2/STAT3信号通路的调节可通过内源性线粒体途径诱导细胞凋亡[19]。Bcl-2蛋白家族是细胞凋亡研究中最重要的癌基因之一，在线粒体介导的内源性凋亡通路中起着重要的作用，其包括抑制凋亡蛋白Bcl-2和诱导凋亡蛋白Bax两大类[20-21]。内源性线粒体途径是在Bcl-2蛋白家族的调节下在线粒体水平上启动的[22]。当外源刺激激活线粒体中的Bcl-2和Bax时，线粒体的膜通透性将发生变化[23];随后，线粒体中的Cyt-c大量释放到细胞质中，进而促使Caspase-9和Caspase-3激活而转化为活性状态（Cleaved-caspases），最终导致细胞凋亡[24]。线粒体通过激活细胞死亡起始因子Caspase-9介导凋亡信号转导，激活的Caspase-9激活切割执行者Caspase-3，然后活化的Caspase-3会裂解聚二磷酸腺苷核糖聚合酶，进而导致细胞凋亡[25]。本研究显示，GL63处理可以降低RBE细胞中JAK2和STAT3蛋白磷酸化水平，诱导Bcl-2蛋白表达下调和Bax蛋白表达上调;同时，GL63能升高Cyt-c表达水平，使Pro-caspase-9和Pro-caspase-3蛋白表达下调、Cleaved-caspase-9和Cleaved-caspase-3蛋白表达上调，提示Caspase-9和Caspase-3被激活。這也证明，GL63可同时通过线粒体介导的内源性途径来诱导RBE细胞发生凋亡。

綜上所述，GL63能通过抑制JAK2/STAT3信号通路来实现对人胆管癌RBE细胞增殖、迁移和侵袭的抑制并诱导其发生凋亡;其具备成为有效治疗或预防胆管癌的药物的潜能。

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（收稿日期：2020-07-30 修回日期：2021-01-10）

（編辑：段思怡）