碳酸酐酶固定及在二氧化碳捕集应用研究进展

于 洋，刘 琦，吕 静，罗 聃，彭 勃

(1.中国石油大学(北京) 非常规油气科学技术研究院 温室气体封存与石油开采利用北京市重点实验室，北京 102249；2.中国石油大学(北京) 新能源与材料学院，北京 102249)

0 引 言

化石燃料如煤、石油和天然气的使用向大气中排放大量二氧化碳是导致气温上升、海平面变化和极端天气等现象发生的主要原因。但受能源供应与需求的影响，目前主要能源仍是化石能源[1]。因此，减少因使用化石燃料产生的二氧化碳排放至关重要。二氧化碳捕集、利用及封存(CCUS)技术在减少碳排放的同时，还可将CO2转化为有价值的产品，在控制全球气候变化、维持经济可持续性发展方面发挥了重要作用[2]。

目前CO2捕集技术主要有物理/化学吸收法、吸附法、膜吸收法和生物固定法等[3]。其中，利用碱性液体吸收剂将CO2直接从烟气中分离的化学吸收法，具有分离效率高、成本低等优点，是目前最成熟的工艺[4]。但存在解吸过程中消耗能量较多、溶剂长期使用会产生降解并造成设备腐蚀性等问题[5]。碳酸酐酶(Carbonic anhydrase，CA)是一种高效的CO2水合催化剂。将CA应用在CCUS技术中，可以提高CO2的吸收效率，有效解决传统工艺中的热能损失，逐渐成为二氧化碳捕集与封存研究中的热点。CA捕集CO2技术具有环境友好、能耗低、可再生、无二次污染等优点[6]。

CA是一种以Zn2+为活性中心的金属酶，具有巨大的生物催化潜力。目前，利用碳酸酐酶法捕集CO2的主要机理是利用碳酸酐酶催化CO2水合生成碳酸氢根后，在Ca2+、Mg2+等金属离子的参与下将CO2以碳酸盐形式固定下来。然而，CA成本较高、游离CA在高温和废气含量大等恶劣条件下稳定性差、可重用性差，限制了其工业应用。固定化酶技术是利用物理或化学手段解决上述问题的有效方法之一。将游离酶封锁在载体材料内或限制在一定区域内进行催化作用的一种技术。CA固定化保持了游离CA反应条件温和、高效专一等特性，同时又弥补了游离CA的不足，具备储存稳定性高、易于分离回收、可重复使用、连续操作可控、工艺设备简便等优点，固定化技术扩大了酶在实际生产中的应用范围[7]。常用的载体材料可分为高分子材料、无机材料、聚合物-无机复合材料等。根据使用场合和要求来选择合适的载体材料和固定化方法对于获得理想性能的固定化CA至关重要[8]。

本文介绍了碳酸酐酶的固定方法和载体材料以及碳酸酐酶在二氧化碳捕集中的作用机理，总结了碳酸酐酶在促进化学溶剂吸收二氧化碳和诱导二氧化碳矿化生成碳酸钙的最新研究进展。

1 碳酸酐酶的固定化

CA是已知催化CO2水合速率最快的酶，其催化吸收速率可达106s-1。在有机胺溶液中加入CA可以显著降低解析时需要的温度，大大减少再生所需能耗[9]。由于CA自身的热稳定性不高和重复利用率较低，限制了其大规模应用，因此，分子修饰、定向进化和酶固定化等被用来提高其稳定性和活性[10]。化学修饰分为残基特异性修饰和基团特异性修饰。徐霞等[11]将BacillusClausii中CA上的29位天冬氨酸、233位甘氨酸或83位天冬氨酸进行突变，构建含有目的基因的载体，有效提高了CA在高温条件下的CO2捕集转化效率。Alvizo等[12]利用定向进化技术，筛选出高度稳定的CA变异体，在pH>10.0的4.2 mol/L碱性胺溶剂下，该变异体能耐受高达107 ℃的温度，极大提高了普通脱硫弧菌β类CA的性质。虽然前2种方法可以提高CA对高温、极端pH值等极端操作条件的抵抗力，但需通过固定化来提高CA的可重用性，且酶固定化具有方便、直接等优点，常被作为提高CA稳定性和活性的技术手段之一[13]。

1.1 碳酸酐酶的固定方法

由于酶易变性和失活，合理的固定化可以提高酶的刚性和稳定性，以克服其在实际应用中的局限性。通常酶固定化方法包括物理法和化学法。物理法分为吸附法和包埋法，化学法分为共价结合法和交联法[14]。4种酶固定方法如图1所示。吸附法是最简单的酶固定方法，包括物理吸附和离子交换吸附。吸附法利用载体和酶之间的物理相互作用力(如范德华力、离子键合、氢键、电荷转移、亲疏水性等)将酶固定在载体表面[15]。包埋法又可以分为凝胶包埋法和微囊化包埋法。凝胶包埋将酶限制在高聚物网格中，而微囊化包埋则将酶置于不同构型的膜外壳内。共价结合法是指酶蛋白分子的功能基团与载体表面基团之间以共价键结合的一种固定化方法。因此，以共价结合法制备生物复合酶时，需对载体进行改性，使其表面附着氨基、羧基、羟基、醛基等功能性基团[16]。交联法将酶分子和双功能或多功能试剂分子之间以共价键结合，再与载体材料进一步结合。4种固定化方法的优缺点见表1，酶的固定化方法要根据酶的应用领域选择。

图1 CA固定方法[17]

表1 CA固定方法优缺点

1.2 碳酸酐酶固定化载体

载体的选择会显著影响固定化酶的性质，制备理想的固定化酶既要选用合理有效的固定化方法，还要选择良好的载体。通常在选择固定化载体材料时需考虑以下几点：① 载体的理化性质，如形状、大小、孔径、机械强度、不易溶于反应介质、强酸碱和高温条件下的稳定性、耐微生物降解能力等；② 载体的工业应用能力，材料价廉易得、可进行工业化大生产、可再生循环使用等[21]。

传统的固定化载体主要是以动植物结构蛋白为主的天然高分子产物，如从虾的甲壳中提取的壳聚糖、甲壳素；从海藻中可以提取海藻酸钠等。此外还包括琼脂糖珠、琼脂糖凝聚、卵清蛋白、木质纤维等[22]。近几年，包括碳基材料、硅基材料、金属氧化物等在内的无机载体材料研究较多，且大量研究利用化学试剂对材料改性后再用于固定CA，使固定化CA的稳定性、可重复利用性更好。固定化CA的种类及其载体见表2。牛建杰等[23]以γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷(GPTMS)为改性剂对纳米颗粒进行改性，得到了环氧基功能化的Fe3O4-SiO2核壳纳米颗粒，随后将碳酸酐酶CA共价固定到纳米颗粒上，以实现CA固定化。结果表明，固定化酶的热稳定性、贮藏稳定性和循环使用性均优于同等条件下的游离酶，其在循环使用10次后仍保持84.2%的相对酶活力。Jing等[24]成功将CA固定在磁性聚微球上，与游离CA相比，固定化CA具有更好的酶活性、较好的可重用性、更高的热稳定性。经过6次重复使用后，活性为最初的47.6%。Kim等[25]将大肠杆菌核糖体蛋白L2与海洋细菌海洋氢基因弧菌(hmCA)的CA基因融合，构建的融合蛋白成功自固定到硅藻生物硅，制备的固定化酶具有较高的稳定性。Peirce等[26]在存在碳化二亚胺的条件下，通过共价键将耐热的CA固定在顺磁性Fe3O4纳米粒子(NPs)上，最大载酶量为40 mg/g(以NPs计)。Kumari等[27]将SulfurihydrogenibiumazorenseCA(SazCA)与纤维素结合模块(CBM3)融合后得到的重组蛋白BMC-SazCA可与微晶纤维素珠子紧密结合，将固定化酶应用于催化CO2水合反应，10个循环后，固定化BMC-SazCA的活性约为新鲜制备固定化BMC-SazCA的90%。

表2 固定化CA载体

2 碳酸酐酶在二氧化碳捕集中的应用

2.1 对化学溶剂吸收二氧化碳的促进作用

利用化学吸收法捕集二氧化碳常用的化学溶剂为醇胺和金属碱性试剂[37]。醇胺溶液包括一乙醇胺(MEA)、二乙醇胺(DGA)、哌嗪(PZ)、二乙烯三胺(DETA)、甲基二乙醇胺(MDEA)和五甲基二乙烯三胺(PMDETA)等[38]。金属碱性试剂有碳酸钾、氢氧化钠、氢氧化镁等。利用醇胺溶液吸收CO2具有较大的吸收容量，易解吸、腐蚀低，但产物易降解，吸收焓较高，吸收速率有待提升。利用碳酸钾(K2CO3)溶液吸收CO2需要较低的再生能量，对环境更友好，但其吸收动力学较慢，因此需要大型且昂贵的吸收柱才能操作。碳酸酐酶稳定性好，在加快CO2水合速率的同时又可以降低吸收焓。因此，大量研究表明在醇胺或金属碱性试剂中加入碳酸酐酶，可以使CO2捕集工艺同时具有高吸收容量、较快吸收速率和较低解吸能耗[39]。

Silverman等[40]探讨了碳酸酐酶的结构和催化机理，结果表明，尽管不同类型的CA具有不同的蛋白质序列，但催化的活性中心都是带羟基的Zn2+离子，CA的加入可明显提高CO2水合速率。CA催化水合反应机理如图2所示。在分子间质子转移中，CA处于活性状态，氢氧离子结合到锌上，二氧化碳分子靠近氨基酸侧链，这里称为质子通道，向溶液中的缓冲分子释放质子。然后结合锌的羟基对碳原子进行亲核攻击与附近的二氧化碳分子反应，产生结合锌的碳酸氢盐。水分子将碳酸氢盐交换到溶液后，酶处于不活跃状态，水与锌结合。为了恢复CA的催化活性，必须从与锌结合的水分子中去掉一个质子。质子通过质子通道完成分子内质子转移，这种转移发生在氢键水分子之间[41]。

图2 CA催化水合反应的机理[42]

使用MEA溶剂吸收CO2是迄今为止捕集CO2最成熟的技术。但MEA溶剂仍存在再生能量高、溶剂降解、挥发性大、毒性大等问题[43]。Feron[44]认为可形成碳酸氢盐的溶剂(如叔胺和碱性碳酸盐)是一种很有前途的替代物。Gladis等[45]探究了碳酸酐酶对MEA、2-氨基-2-甲基-1-丙醇(AMP)、MDEA和K2CO3溶剂吸收CO2能力的影响。研究表明，CA的加入对各溶剂液相传质系数的影响依次为：MDEA显著提高，K2CO3和AMP略有增加，而MEA基本不变。说明CA对于可形成碳酸氢盐溶剂的催化效果更好。Leimbrink等[46]将包埋在有机硅基聚合物基质中的CA加入MDEA水溶液后，与空白MDEA溶剂相比，在固定化CA的存在下，CO2总吸收摩尔流量增加了6倍。Gladis等[47]研究发现，CA的加入对提高MDEA溶剂CO2捕集率有积极影响，增加酶的添加量可进一步提高捕集效率。中试吸收试验表明，CA的加入对CO2传质速率有明显促进作用，30%的MDEA溶剂在10 m柱高时可捕集18%～23%CO2，在相同液气比范围内，加入0.85 g/L CA后的CO2捕集率在36%～49%。当CA浓度增加到3.5 g/L时，捕集效率高达48%～83%。Ai等[48]将固定在环氧磁性复合微球上的CA酶加到10%的MDEA溶液中，CO2吸收速率比原MDEA溶液提高近40%，反应平衡时间从150 min缩短到90 min，经7次循环使用后，固定化CA的活性在313.15 K时仍接近其初始值。刘彬等[49]研究发现牛碳酸酐酶(BCA)的加入可显著提高MDEA吸收CO2的反应速率，且反应速率随BCA浓度的增加而增大。CA在二氧化碳捕集中的催化性能见表3。

表3 CA在二氧化碳捕集中的催化性能

K2CO3溶液使用时需要较低的再生能量，更环保，但吸收动力学较慢，因此需要较大且昂贵的吸收塔才能操作。这一工业限制可以向K2CO3溶液中添加CA等促进剂来解决。Hu等[54]用湿壁柱测定了323 K下，耐热CA在30% K2CO3溶液(pH=11～12)中的催化系数为5.3×108M-1s-1。耐热CA在pH=10.6～10.8、323 K的30% K2CO3溶液中连续运行8 h后较稳定，初始催化效率仍保持在70%以上。Qi等[52]在吸收塔温度40 ℃、汽提塔压力35 kPa条件下，在23.5% K2CO3溶剂中加入2.5 g/L的CA，集成小试系统成功运行500 h后，CO2平均捕集率为84%。通过湿壁柱试验表明，当加入2 g/L CA时，CO2传质系数可显著提高5倍。

2.2 对二氧化碳矿化生成碳酸钙的诱导作用

随着碳浓缩机制的发展，一些细菌可以将高含量CO2转化为碳酸钙(CaCO3)、生物燃料和生物表面活性剂等高附加值产品。CA将CO2通过生物矿化固定为CaCO3的过程中发挥了重要作用。利用CA诱导矿化是一种高效、稳定、生态友好且可长期储存CO2的方法[60]。Li等[61]研究表明CA可以加快CaCO3的沉淀速率，CaCO3主要晶相为方解石。Cizer等[62]研究表明CA有利于形成稳定的CaCO3，并通过形成新的晶面显著改变其形态。CA诱导CaCO3沉淀的实质是催化水中Ca2+与CO2的反应[63]。微生物产CA诱导CaCO3沉淀机理如图3所示，反应方程[64]为

1)气态二氧化碳溶解于水中，生成水合二氧化碳：

(1)

2)水合二氧化碳与水反应生成H2CO3：

(2)

(3)

(4)

(5)

图3 微生物诱导碳酸钙在溶液中沉淀的机理模型[64]

上述反应中影响CaCO3生成的限速步骤主要是CO2和水反应生成碳酸氢盐。自然界中，CO2水合反应速率相当慢，转化系数仅为1.3×10-1s-1，CA存在可以加速上述反应，CO2水合物转化系数显著提高到1.0×106s-1，是自然界的107倍。因此，CA加速CO2的水合反应是CaCO3沉淀的主导因素。

在CA诱导矿化过程中，CA活性受各种因素影响，如温度、酸碱度和Ca2+浓度。因此，研究不同因素对CA活性的影响，进一步阐明CA促进CaCO3矿化的机理具有重要意义。Li等[65]研究了不同Ca2+浓度下CA催化CaCO3沉淀的动力学。CaCO3沉淀速率随Ca2+浓度的增加而增加，但Ca2+浓度高于100 mmol/L时对CA催化CaCO3沉淀有负面影响。Li等[66]研究了CA在初始pH分别为6.0、6.5、7.0和8.0时促进CaCO3沉淀的动力学。结果表明，初始pH=8.0时，体系中Ca2+离子在48 h内完全沉淀，分别比初始pH为6.0、6.5和7.0时提前21、15和14 h，说明在试验pH范围内，较高的pH值有利于CA催化CaCO3沉淀。袁亮[67]研究了温度、pH值和Ca2+浓度对细菌生长、CA活性的影响。结果表明，25 ℃时CA活性最高，有利于CaCO3沉淀；初始pH值为8.5时，CaCO3沉淀最多；Ca2+浓度为50 mmol/L时，细菌生长繁殖最好，过低的Ca2+浓度会影响CaCO3生成，而过高的Ca2+浓度则会严重影响细菌生长，降低细菌活性。

3 结语与展望

碳酸酐酶(carbonic anhydrase，CA)是一种以Zn2+为活性中心的金属酶，具有巨大的生物催化潜力。但由于CA自身的热稳定性不高和重复利用率较低，限制了其大规模应用，因此，分子修饰、定向进化和酶固定化等被用来提高其稳定性和活性。近几年研究方向逐渐将这几种策略结合起来，如将分子修饰后的CA进行固定化应用于CO2捕集。固定化载体材料不仅具有较高的机械和化学稳定性，还要避免外界因素导致CA浸出，更重要的是，这种新型材料的制备条件应简单温和，很好地保留固定化过程中CA的活性。此外，载体材料应与底物有足够的亲和力，以增强CO2的捕集和传质。虽然CA可以通过CO2的水合作用促进碳的捕集和分离过程，但离实际应用还有差距。对此，可从以下方面进行研究：

1)开发具有更高活性和稳定性的新型CA。利用基因克隆、蛋白质工程和合成生物学等理论，可以设计出对各种极端环境适应性强的游离CA。

2)廉价高性能载体材料的开发。载体材料应具有较高的机械和化学稳定性，以抑制CA浸出、避免外界侵袭。此外，新型材料的制备条件应简单温和，以很好地保留固定化过程中CA的活性。

3)进一步探究CA内在因素和外界条件对其工业应用产生的阻碍，如酶的成本、批量生产、热稳定性、贮藏稳定性、催化寿命以及其对SOx和NOx等烟道气成分的耐受性等问题。