HPLC-ELSD 法测定3 种广式凉果中的返砂糖

◎ 张增榜，张国列，张泽佳，黄智兴，李锦添，吴巨贤，黄百祺

（1.广东同享食品有限公司，广东 揭阳 515300；2.广东食品药品职业学院生物技术学院，广东 广州 510520；3.广东科贸职业学院餐旅学院，广东 广州 510430；4.广东科贸职业学院现代岭南饮食传承创新研发广东省普通高校工程技术中心，广东 广州 510430）

凉果是广东传统糖制产品之一，其历史可追溯到唐宋时期。传统广式凉果要经过盐腌、脱盐、漂烫、糖渍和干燥等诸多程序，品质正常的广式凉果颜色鲜亮、质地柔软，其中糖渍工艺和糖浆的组成是影响其质量的重要的环节之一[1]。如果糖熬制和糖渍工艺不当，产品在生产、贮存和运输过程中表面会出现白色或黄褐色的结晶糖霜，导致质地粗糙变硬、表面失去光泽，此现象称为“返砂”[2]。凉果“返砂”不仅严重影响产品质量和企业形象，而且往往被消费者误认为产品发生了霉变，直接影响其价格，从而影响企业经济效益。

“返砂”现象在传统凉果生产过程中比较常见。研究表明，产品中转化糖的比例对产品的质量有重要的影响，蔗糖转化度在30%以下时，凉果容易发生“返砂”，转化度高于70%容易发生吸湿“流糖”现象，适当的转化度（40%～60%）能抑制“返砂”[3]。目前，关于凉果“返砂”的研究主要在糖浆渗糖工艺[4]、回糖法抑制返砂[5]等方面，而对返砂糖成分的分析较少。水溶性糖的测定方法有化学法、酶电极法、毛细管电泳法、气相色谱法和高效液相色谱法等。化学法适用于还原糖和总糖的测定；酶电极法是一种只针对葡萄糖的分析方法；因糖类物质不含发色官能团，利用气相色谱和液相色谱-紫外检测法进行检测时，需对其进行紫外衍生，操作繁琐[6]。目前使用较多的是液相色谱-示差折光检测法，但示差检测器灵敏度低、稳定性差且无法用于梯度洗脱；蒸发光散射检测器（Evaporative Light Scattering Detector，ELSD）是一种通用型质量检测器，它对有质量的物质都能进行检测，特别适合无紫外吸收的糖类物质的检测，灵敏度可达示差检测器的10 倍[7]。为深入了解“返砂”的成因，试验选取情人梅、加应子和乌李3 种典型广式凉果“返砂”产品，通过建立高效液相色谱-蒸发光散射法（HPLC-ELSD）测定返砂糖的组成和含量，为提升广式凉果传统加工工艺和产品品质提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

情人梅、加应子、乌李返砂样品，均由广东同享食品有限公司提供。

乙腈（色谱纯），由美国BCR 公司提供；蔗糖（纯度≥99%）、葡萄糖（纯度≥99%）、果糖（纯度99%），均由上海泰坦科技股份有限公司提供。

1.2 仪器与设备

Shimadzu 高效液相色谱仪（LC-16 二元泵、CTO-16 柱温箱、SIL-16 自动进样器与ELSD-LT II 蒸发光散射检测器，岛津公司）、M204e 型电子天平（梅特勒-托利多公司）、Synergy 型超纯水系统（默克密理博公司）。

1.3 色谱条件

色谱柱：Shodex Asahipak NH2P-50 4E（4.6 mm× 250 mm，5 μm）；流动相：乙腈-水（70 ∶30，V/V）；流速：1 mL·min-1；柱温：25 ℃；进样量：10 μL；蒸发光检测器：载气为N2，压力为350 kPa，漂移管温度为60 ℃。

1.4 试验方法

1.4.1 对照品溶液配制

精密称取蔗糖对照品1.001 7 g，葡萄糖对照品1.004 0 g，果糖对照品1.000 6 g，置于100 mL容量瓶中，以纯化水溶解并稀释至刻度，得蔗糖、葡萄糖、果糖质量浓度分别为10 mg·mL-1、10 mg·mL-1、10 mg·mL-1的混合对照品溶液。

1.4.2 供试品溶液配制

小心刮取情人梅返砂样品表面的结晶糖，精密称取0.102 6 g，置于10 mL 容量瓶中，以纯化水溶解并稀释至刻度，即得。

1.4.3 系统适用性试验

吸取混合对照品溶液适量，用0.22 μm 微孔滤膜滤过，取续滤液按1.3 色谱条件进行测定，记录色谱图。

1.4.4 线性关系考察

分别精密吸取混合对照品溶液1.0 mL、2.0 mL、4.0 mL、6.0 mL、8.0 mL 和10.0 mL，置于10 mL 量瓶中，以纯化水稀释至刻度，用0.22 μm 微孔滤膜滤过，取续滤液按1.3 色谱条件进行测定，记录峰面积。分别以蔗糖、葡萄糖和果糖的峰面积为纵坐标（y），以质量浓度为横坐标（x）绘制标准曲线，计算线性回归 方程。

1.4.5 检出限和定量限

取混合对照品溶液适量用纯化水逐级稀释，按1.3进行色谱分析，以3 倍信噪比（S/N=3）的方法计算检出限（LOD），以10 倍信噪比（S/N=10）的方法计算定量限（LOQ）。

1.4.6 精密度试验

精密吸取混合对照品溶液10 μL，按1.3 色谱条件进行测定，连续进样6 次，记录色谱图，计算峰面积的相对标准偏差（RSD）。

1.4.7 稳定性试验

将供试品溶液在室温下分别放置0 h、4 h、8 h 和12 h 后，精密吸取10 μL，按1.3 色谱条件进行测定，记录色谱图，计算峰面积的RSD。

1.4.8 重复性试验

按1.4.2 方法制备供试品溶液6 份，分别精密吸取10 μL，按1.3 色谱条件进行测定，记录色谱图，计算峰面积的RSD。

1.4.9 加标回收率试验

精密称取已知含量的供试品0.1 g，共3 份，以供试品中蔗糖、葡萄糖、果糖含量约80%、100%和120%的比例分别加入3 种糖对照品，按1.4.2 方法制备供试品溶液，按1.3 色谱条件进样测定，记录峰面积，重复3 次，计算平均回收率和RSD。

2 结果与分析

2.1 系统适用性试验

混合对照品溶液色谱图见图1。果糖、葡萄糖和蔗糖在10 min 内达到基线分离，相对保留时间分别为5.814 min、6.952 min 和8.410 min，理论塔板数均大于5 000，表明该色谱条件对3 种糖的测定有效、适用。

图1 对照品色谱图

2.2 线性关系、检出限、定量限

根据峰面积（y）对质量浓度（x）绘制标准曲线，得到3 种糖的线性回归方程；按3 倍信噪比（S/N=3）的方法计算检出限（LOD），按10 倍信噪比（S/N=10）的方法计算定量限（LOQ），结果见表1。结果表明，在1 ～10 mg·mL-1的浓度范围内，3 种糖的信号响应值与浓度线性关系良好，线性相关系数均大于0.999 5。

表1 3 种糖的回归方程、线性相关系数、线性范围、检出限及定量限表

2.3 精密度、稳定性和重复性实验

混合对照品溶液连续进样6 次，果糖、葡萄糖和蔗糖峰面积的RSD分别为0.87%、1.27%和1.03%，表明仪器的精密度良好。混合对照品溶液在0 ～12 h内果糖、葡萄糖、蔗糖峰面积的RSD分别为3.63%、2.08%和1.60%，表明3 种糖在测定条件下12 h 内稳定。6 份供试品溶液中果糖和葡萄糖峰面积的RSD分别为0.41%、0.88%，表明测定方法的重复性良好。

2.4 加标回收率试验

以情人梅为代表，按供试品中果糖、葡萄糖和蔗糖含量以低（80%）、中（100%）、高（120%）的比例加入3 种糖的对照品，考察加样回收率，结果见表2。3 种糖的加样回收率为95.12%～104.65%，RSD在2.42%～2.94%，表明测定方法过程可控、样品前处理方法可行。

2.5 样品测定

选取出现“返砂”现象的3 种凉果产品情人梅、加应子、乌李，每种抽取3 个批次进行测定，结果见表3 和图2。3 种凉果的“返砂”糖中均未检测到蔗糖，主要为葡萄糖和果糖，其中葡萄糖含量约为果糖的4 ～7 倍。由此推测，造成这几种凉果“返砂”的原因并非在糖浆熬制时蔗糖转化不够，而是转化过度导致果脯中转化糖含量过高。一方面导致常温糖渍时葡萄糖浓度大于其溶解度从而容易产生结晶附着，另一方面在高温潮湿季节容易产生“流糖”，当进入低温干燥季节后，“流糖”在果脯表面结晶进而产生“返砂”[8]，这与广式凉果一般在进入秋冬季节后才出现“返砂”的规律一致。

表2 加样回收率试验表

图2 样品色谱图

表3 3 种凉果返砂糖检测结果表

3 结论

建立了高效液相色谱-蒸发光散射法同时测定凉果“返砂”糖中3 种成分的检测方法。结果表明，蔗糖、葡萄糖、果糖在10 min 内达到基线分离，色谱响应值在1 ～10 mg·mL-1的浓度范围内线性关系良好，检出限分别为0.088 5·L-1、0.081 6·L-1和0.059 6 g·L-1，加标回收率在95.12%～104.65%。该方法分析速度快、结果准确、重现性好、操作简单，满足凉果等果蔬糖制品的快速检测要求。利用该方法对3 种凉果“返砂”糖的成分进行了分析，结果显示“返砂”糖主要为葡萄糖和果糖，转化糖含量过高可能是“返砂”的一种原因。