十二井穴流注放血干预急性脑缺血模型大鼠HSP70及CD31表达的研究*

赵婷婷 郝利芳 张 蕊 赵立新

（山西省中医院，山西 太原 030012）

急性脑缺血（ACI）是由于脑动脉血管闭塞导致的脑部血液循环障碍，造成脑组织缺血坏死并伴随不同程度的神经功能缺失及其他后遗症［1］，临床病理表现为神经元、神经胶质细胞减少［2］，是具有高致残和致死率的急性心脑血管疾病之一。ACI常见治疗方法有药物治疗、手术治疗外及干细胞替代治疗等［3-4］。近年来中医中药对ACI的治疗研究及效果受到广泛关注，其中十二经脉气血流注理论也应用于ACI的治疗中［5-7］。本研究针对ACI在辰时时段高发的特点，结合不同时辰气血运行至不同经络的特点给予脑缺血模型大鼠十二井穴流注放血疗法干预，比较十二井穴流注放血疗法和普通十二井穴放血对ACI的治疗效果，为中医临床治疗ACI提供新的思路和方法。

1 材料与方法

1.1 实验动物

2～3月龄SD大鼠60只，雌雄各半，体质量（220.0±10.0）g，由山西省中医药研究院动物实验中心提供。饲养条件为（23.0±1.5）℃恒温、（60.0±5.0）%恒湿，12 h昼夜节律交替，适应性喂养1周后进行造模。本实验通过山西省中医药研究院动物伦理委员会的审批，严格按照动物伦理委员会的各项要求执行。

1.2 试药与仪器

1）试药：免疫组化PV-9000检测试剂盒、DAB显色液购自北京中杉金桥生物公司；anti-CD31、anti-HSP70抗体购自武汉博士德生物工程有限公司；丁苯酞软胶囊（0.1g/粒）购自石药集团恩必普药业有限公司。2）仪器：针灸针（30号，1寸，汉医牌）；2135型组织切片机（德国Leica）；Moticam 3000显微摄影成像系统（美国Motic）；932型电热烧灼器（上海医疗电子仪器厂）；Olympus光学显微镜（日本Olympus）。

1.3 造模及分组

实验动物随机分为假手术组、模型组、普通放血组、流注放血1组、流注放血2组、西药组，每组10只，分笼饲养。除假手术组外，其余各组参照局灶性凝结大脑中动脉法［8］建立大鼠大脑中动脉梗阻（MCAO）模型，方法如下：腹腔注射200 μL 0.4%戊巴比妥钠溶液麻醉后右侧卧位固定大鼠，剃去耳后至颈部鼠毛后消毒处理，沿眼眶后至耳的连线中点纵向切口1～2 cm，暴露颌骨，轻抬头部可见横过嗅束上行的大脑中动脉（MCA）。用烧红的电阻丝轻靠接触嗅束上缘暴露的MCA，使之发生快速凝闭，若发生血管破裂出血应用小棉球局部轻压止血，诱发MCAO模型。假手术组大鼠仅用玻璃分针游离出单侧MCA，不做诱导处理。切口缝合并消毒，以术后出现同侧霍纳氏（Homer）综合征、左侧肢体疼痛回缩迟钝或消失、对侧偏瘫、活动时出现左侧倾倒及悬尾时出现左上肢向胸前屈曲等作为造模成功标准。

1.4 干预方法

1）普通放血组：选取位于大鼠四肢趾端的十二井穴，每侧计6穴。用胶布处理毫针针尖，使其刺入皮肤深度限定在1 mm。用处理后的毫针每日7∶00依次按照少商、商阳、中冲、关冲、少冲、少泽、涌泉、隐白、大敦、厉兑、足窍阴、至阴穴的顺序点刺放血，每穴放血量为1滴。2）流注放血1组：取穴、放血量均与普通放血组相同。依照十二经脉流注次序，从当值经脉的井穴开始，每日7∶00取大鼠四肢对应人十二井穴解剖位置［9］，依照厉兑、隐白、少冲、少泽、至阴、涌泉、中冲、关冲、足窍阴、大敦、少商、商阳顺序，先左侧后右侧依次放血。3）流注放血2组：取穴、放血量均与普通放血组相同。依照十二经脉流注次序，在经脉流注和井穴交接时刻，选择当值经脉的井穴放血，每日5∶00（寅时-卯时交接）先后放肺经和大肠经之少商、商阳穴；9∶00（辰时-已时交接）放胃经和脾经之厉兑、隐白穴；13∶00（午时-未时交接）放心经和小肠经之少冲、少泽穴；17：00（申时-酉时交接）放膀胱经和肾经之至阴、涌泉穴；21∶00（戌时-亥时交接）放心包和三焦经之中冲、关冲穴；1∶00（子时-丑时交接）放胆经和肝经之足窍阴、大敦穴。4）西药组：造模后按80 mg/kg腹腔注射10 mg/mL的丁苯酞稀释液，治疗时间与普通放血组针刺放血时间相同。5）假手术组及模型组：分别给予等量生理盐水腹腔注射，正常喂养。治疗1周后各组进行神经功能学评分及相关指标检测。

1.5 标本采集与检测

1.5.1 神经功能学评分 依据改良的神经功能缺陷评分量表（mNSS）［10］对大鼠神经功能进行打分评定，通过对提尾、平衡木、握力、运动能力、感知能力及反射能力打分评估模型大鼠的治疗及预后情况，最高分数18分，分数越高代表神经系统功能损害越严重。分别于治疗前、治疗1周后记录各组大鼠的评分情况，每只大鼠重复测定3次。每只大鼠重复测定3次。

1.5.2 脑组织缺血区病理变化 各组大鼠于神经功能评分完成后给予10%水合氯醛腹腔深度麻醉，迅速开胸暴露心脏，心脏灌注处死。断头取脑，脑组织置于4%多聚甲醛溶液中4℃固定过夜，组织浸蜡包埋，冷冻切片后用多聚耐氨酸固定于载玻片上，HE染色观察大鼠脑组织病理形态学改变，观察神经元是否皱缩及数量变化。

1.5.3 脑组织缺血区HSP70、CD31表达 免疫组化参照PV-9000试剂盒说明书，分别取脑组织切片，经枸橼酸钠抗原修复后采用两步法染色检测缺血区及周围脑组织HSP70及CD3蛋白表达情况，每组大脑在高倍镜视野下随机选取3个缺血区视野，拍照并计数视野内阳性细胞数量，图片采用Image-pro plus6.0病理图像分析系统，取均值比较各组大鼠组织水平相关蛋白表达差异。

1.6 统计学处理

2 结 果

2.1 造模后大鼠一般情况

除假手术组，其余5组大鼠造模后均出现不同程度的同侧霍纳氏（Homer）综合征、左侧肢体疼痛回缩迟钝或消失、对侧偏瘫、行走时出现左侧倾倒及悬尾时出现左上肢向胸前屈曲等行为异常表征，mNSS评分组间不存在明显差异（表1），均符合本研究纳入标准用于实验治疗。

2.2 各组大鼠mNSS评分结果比较

见表1。根据mNSS评分结果下显示假手术组大鼠治疗前后均无神经功能缺陷，模型组大鼠治疗前后均表现为明显神经功能缺陷，普通放血组、流注放血1组、流注放血2组和西药组大鼠治疗后mNSS评分均较治疗前显著降低（P＜0.05）；与普通放血组相比，流注放血2组、西药组大鼠治疗后mNSS评分显著降低（P＜0.05），同时西药组与流注放血2组大鼠治疗后mNSS评分间无显著差异（P＞0.05）。

表1 各组大鼠mNSS评分结果比较（分，±s）

表1 各组大鼠mNSS评分结果比较（分，±s）

注：与本组治疗前比较，*P＜0.05；与普通放血组比较，△P＜0.05；与西药组比较，▲P＜0.05。下同。

治疗后0.50±0.01 13.33±1.67 10.26±1.01*▲9.66±0.88*▲8.35±0.69*△7.53±0.70*△组别假手术组模型组普通放血组流注放血1组流注放血2组西药组n 10 10 10 10 10 10治疗前1.00±0.02 13.14±1.41 12.86±1.26 13.19±1.19 13.05±0.94 13.21±1.54

2.3 各组大鼠脑组织病理变化

见图1。结果显示，假手术组大鼠脑组织结构完整，染色清晰，细胞正常，无明显病理改变。模型组大鼠病理变化较为严重，显微镜下可见组织严重破损，神经元细胞大量丢失，胶质细胞增生并伴有大面积的血细胞聚集，局部存在炎性细胞浸润。普通放血组大鼠病理切片较模型组相比组织结构略有恢复，其他方面改变差异并不明显。流注放血1组大鼠脑组织破损已大部分恢复，细胞仍大量肿胀。流注放血2组大鼠脑组织结构基本恢复，神经元多数处于完整正常状态，但局部仍可见损伤区域周边存在较多细胞膨大、胞核皱缩等现象。西药组大鼠脑组织结构基本恢复正常，细胞形态及数量显著恢复，胶质细胞略有增生，少量细胞存在凋亡现象。

图1 各组大鼠脑组织病理变化（HE染色，200倍）

2.4 各组大鼠脑组织HSP70、CD31蛋白表达比较

见表2，图2～图3。免疫组化染色后HSP70及CD31阳性反应细胞呈棕黄色深染，各组大鼠脑组织切片中阳性细胞表达量计数结果见表2。与模型组大鼠相比，普通放血组大鼠脑组织中HSP70、CD31蛋白表达量稍有增加但无显著差异（P＞0.05），流注放血1组、流注放血2组及西药组大鼠脑组织中HSP70、CD31蛋白表达量显著增加（P＜0.05）；普通放血组大鼠脑组织HSP70、CD31蛋白表达量与流注放血1组无明显差异（P＞0.05），而显著低于流注放血2组和西药组（P＜0.05）；西药组大鼠脑组织中HSP70、CD31蛋白阳性表达数最多，但与流注放血2组大鼠无显著差异（P＞0.05）。

表2 各组大鼠脑组织HSP70、CD31阳性表达数量比较（±s）

表2 各组大鼠脑组织HSP70、CD31阳性表达数量比较（±s）

组别假手术组模型组普通放血组流注放血1组流注放血2组西药组n 10 10 10 10 10 10 HSP70+20.56±5.15▲15.11±4.96▲19.67±6.86▲24.44±5.79*▲28.89±6.85*△33.78±6.78*△CD31+2.33±1.00▲3.33±1.12▲4.00±0.71▲5.56±1.42*▲7.89±0.78*△8.44±1.24*△

图2 各组大鼠脑组织HSP70蛋白表达（IHC染色，400倍）

图3 各组大鼠脑组织CD31蛋白表达（IHC染色，400倍）

3 讨 论

《灵枢经》《类经》等著作中描述井穴为十二经脉阴阳之气的始发之处［11］，十二经脉的“根”即为各经散布在手足四肢末端的井穴，因此井穴具有清热安神、苏厥镇痛、醒脑开窍等作用，特别对于外感所致的高热久稽、温热邪气引发的高热惊厥以及气血不通所致的躯体痛症的治疗研究较为深入［12］，这其中针灸井穴起效快、疗效显著受到广泛重视。气血在十二经脉内的流注次序从手太阴肺经开始，依次流至手阳明大肠经、足阳明胃经、足太阴脾经、手少阴心经、手太阳小肠经、足太阳膀胱经、足少阴肾经、手厥阴心包经、手少阳三焦经、足少阳胆经、足厥阴肝经，再流至手太阴肺经，形成一个“阴阳相贯，如环无端”的整体循行系统［13］。在十二经脉气血流注理论中，手足阴阳表里经的井穴在四肢末端井井相会能实现阴阳交错，产生经气，经气不断的积聚、充实进而促进经脉气血沿着十二经脉气血循环灌注［14］。

天之阴阳随时间而递相变化，“天人合一，天人相应”，人体阴阳亦随之改变，故可从一日十二时辰所属地支阐述人体阴阳盛衰的节律变化。子午流注学说以一天十二时辰流注十二经，即寅时从肺经开始依次流注大肠经、胃经、脾经、心经、小肠经、膀胱经、肾经、心包经、三焦经、胆经而终止于丑时肝经，遵循气血昼夜流注规律而择时施治即为子午流注纳子法，又称“纳支法”［15］。井穴针灸基于这一理论遵循十二经脉气血流注的各时辰和井穴循序逐渐发展和完善了起来，针对不同疾病的时间医学规律和日夜节律变化给予了新的治疗思路和方法。

本研究选取大鼠双侧十二经井穴进行针刺放血治疗，分别设立普通放血组、流注放血1组、流注放血2组，流注放血1组按十二经脉流注次序在单一时段对十二经井穴放血治疗，流注放血2组依照子午流注时间理论对十二经井穴放血治疗：每日寅时-卯时交接时刻先后放肺经、大肠经之少商、商阳；辰时-已时交接时刻放胃经、脾经之厉兑、隐白；午时-未时交接时刻放心经、小肠经之少冲、少泽；申时-酉时交接时刻放膀胱经、肾经之至阴、涌泉；戌时-亥时交接时刻放心包、三焦经之中冲、关冲；子时-丑时交接时刻放胆经、肝经之足窍阴、大敦。比较普通放血法、按经脉流注次序单一时段放血以及子午流注放血对MCAO模型大鼠的治疗效果。结果显示，相较于治疗前，普通放血组、流注放血1组、流注放血2组和西药组治疗方法均对模型大鼠神经功能具有显著改善效果。比较各组治疗后大鼠mNSS评分可见除注射治疗丁苯酞软胶囊阳性药治疗神经缺陷效果最佳外，3组针灸放血方法中流注放血2组治疗效果与西药组无异，普通放血组和流注放血1组治疗效果较差。说明依照十二经脉流注次序，在经脉流注和井穴交接时刻，选择当值经脉针灸放血的治疗方法优于普通放血法和单一时段流注放血方法，其对神经功能缺陷的治疗效果及脑组织损伤区域病理状态的逆行改善效果显著提高。在分子水平，HSP70是热休克蛋白（HSPs）家族的主要成员之一，HSPs受到热休克因子（HSF）诱导相关靶基因上热休克原件（HSE）的表达而激活，因此在正常脑组织中HSP70为显著低表达［16］，在缺氧、缺血及其他应急刺激下HSP70表达量会发生显著变化。本研究模型组大鼠脑组织HSP70表达量最少，各治疗组大鼠HSP70的表达量随其治疗效果改善而增加，同时免疫组化结果显示HSP70的应激性表达分布主要集中于坏死神经元、局部梗死区域及炎性细胞浸润区域周围。以往研究表明，HSP70能够发挥对神经元细胞的保护作用并改善脑内损伤部位炎性环境［17］，提示针灸井穴流注放血方法能够通过激活HSP70的表达分泌，发挥对ACI模型大鼠的治疗作用，推测其作用机制可能与炎症抑制、削弱兴奋性氨基酸对神经元的损伤，清除脑内过氧化物积聚、保护神经细胞有关。另一方面，CD31作为血管内皮特异性标志物［18］，CD31的表达增加表明针灸井穴流注放血能够促进脑血管内皮新生，内皮细胞表达标志物增加改善缺血区脑组织病理结构变化，减少了血细胞在组织内的进一步积聚，与HE染色观测结果一致。同样说明了十二井穴流注放血的治疗方法优于普通针灸放血，能加速脑组织损伤部位血管新生，改善脑血流的循环代谢。

前期研究多集中于脑缺血后即刻给予十二井穴放血对细胞内c-fos蛋白表达调节、脑血管流速双向调节及各井穴电生理等方面的显著调节作用［19-20］。治疗方法也局限于单一治疗时段及针刺顺序，未对针灸井穴和时间与经脉血流循环顺序的相关性加以重视和探究。本研究首次探究了十二井穴流注放血对ACI大鼠脑组织的保护作用及对神经缺陷的调节作用，且其治疗效果优于普通辨证取穴及十二井穴放血法。《针灸大成》［21］记载“刚柔相配，阴阳结合，气血循环，时穴开阖”，表明子午流注取穴施治方法能够调和人体阴阳经脉衔接、疏通经络从而改善气血沟通循环，促进机体功能的恢复。本研究采用的十二井穴流注放血遵循了体内血液流经十二经脉支端随时辰变化的客观规律，择时取穴，符合子午流注“天人合一”“脏气法时”的理论基础［22］。根据体内气血虚衰的周期性变化规律配合气血灌注顺序定时、定序施针放血的治疗方法，有效地激发机体的内在调节功能，并对脑缺血损伤所致血管梗阻、血管阻塞等具有治疗效果，并进一步发现作用机制可能与激活HSP70表达保护神经元，促进脑损伤部位血管新生有关。此外本研究仍需深入探究十二井穴流注放血对脑内多通路、多机制的调节是否起作用，为临床施治提供充分的理论依据。