平喘颗粒通过抑制miR-21的表达对气道炎症及Eotaxin mRNA的影响*

王 珏 孙丽丽 陈 璐 李竹英△

（1.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学，黑龙江哈尔滨 150040）

支气管哮喘（简称哮喘）是一种发病率较高的呼吸系统慢性炎症反应性疾病。有研究显示，目前全世界有哮喘患者约1.5～2亿人，在我国，14岁以上人群支气管哮喘总体患病率为1.24%，大约有2 000万的哮喘患者，患病率呈明显上升趋势［1］。平喘颗粒为黑龙江中医药大学附属第一医院呼吸科治疗哮喘的经验方化裁而来，在改善患者临床症状及肺功能，减少哮喘再发，减轻再发时症状，提高哮喘患者免疫力等方面有良好疗效［2-3］。miR-21存在多种疾病中，有研究发现，miR-21在哮喘大鼠模型中表达显著［4］，在哮喘发病中有重要调节作用。前期研究显示［5］，平喘颗粒可降低哮喘大鼠EOS水平。因此推测平喘颗粒可能通过调节miR-21的表达降低Eotaxin及EOS水平，减轻气道炎症，从而起到治疗作用。本研究通过抑制miR-21的表达，观察肺泡灌洗液（BALF）及外周血中细胞EOS计数及Eotaxin mRNA的表达，进一步探讨平喘颗粒可能降低EOS的机制。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康雌性Wistar大鼠，清洁级，120只，体质量（200±20）g，由依托单位实验动物中心提供，合格证号：SCXK（黑）2008-004，使用许可证号：SYXK（黑）2014-002。动物饲料由依托单位动物实验中心提供，实验室温度18～25℃，相对湿度40%～75%。

1.2 试药与仪器 1）药物。平喘颗粒：淫羊藿200 g，炙麻黄100 g，太子参150 g，黄芪150 g，五味子 150 g，款冬花150 g，地龙100 g，罂粟壳40 g，知母100 g。加水煎煮2次，每次2 h，滤过，取上清液回收乙醇并浓缩至稠膏，加入蔗糖、糊精适量，混匀，制成颗粒，干燥，最终质量1 000 g（由黑龙江中医药大学附属第一医院制备，批号20150102）。2）试剂。卵蛋白（OVA，美国Sigma公司，批号AP0028），Real-time PCR试剂盒（瑞士Roche公司，批号0491391400），cDNA反转录试剂盒（北京全式金生物技术有限公司，批号J20519），miR-21抑制剂（美国Ambion公司，批号AM10206），miR-21阴性对照（美国Ambion公司，批号AM17010）。3）仪器。自制雾化箱（40 cm×35 cm×25 cm），肺功能仪（黑龙江中医药大学实验室提供），超声雾化器（江苏鱼跃医疗设备有限公司），PCR扩增仪（美国Bio-Rad公司），实时定量PCR仪美国Agilent公司，Image Pro Plus6.0图像分析软件（美国Media Cybernetics公司），全自动五类血液分析仪（美国贝克曼库尔特股份有限公司）。

1.3 分组与造模 Wistar大鼠随机分为正常组、模型组、miR-21抑制表达组、miR-21抑制表达载体对照组、miR-21抑制表达+中药组、中药组，每组20只。正常组不做任何处理；模型组、miR-21抑制表达组、miR-21抑制表达载体对照组、miR-21抑制表达+中药组、中药组造成慢性哮喘动物模型。miR-21抑制表达组、miR-21抑制表达载体对照组、miR-21抑制表达+中药组在造模前给予miR-21慢病毒溶液（病毒数量1.0×108/mL）滴鼻，每次0.1 mL。每3日滴1次，共4次。滴鼻前后分别检测血清中miR-21表达情况，表达差异达5倍以上认为造模成功，开始慢性哮喘造模。慢性持续期大鼠造模参照文献［6-7］进行改进：大鼠适应性喂养1周后，应用卵蛋白吸入法建立哮喘大鼠模型，于实验第0、12天，每只大鼠腹腔注射10% OVA溶液（含Ⅱ级1 mg OVA和100 mg氢氧化铝凝胶的无菌抗原液致敏）1 mL致敏，此后每天用5% OVA激发30 min，持续5 d，然后隔日激发1次，共激发6周，造成慢性大鼠哮喘模型。

1.4 干预方法 正常组不做任何处理，模型组、miR-21抑制表达组、miR-21抑制表达载体对照组给予同等体积生理盐水灌胃；miR-21抑制表达+中药组、中药组在第2次致敏后第4天开始给予中药药液灌胃，将中药溶解为含药量1 080 g/L溶液，按5 mL/kg灌胃。各组均于末次激发24 h后处死。

1.5 观察指标 1）大鼠一般情况。观察大鼠精神、体质量、呼吸、饮食等一般情况。2）大鼠BALF及外周血中EOS计数。主动脉穿刺采血后结扎，结扎右肺主支气管。用含1%肝素的无菌生理盐水经气管插管后进行左肺支气管肺泡灌洗，并且重复6次，同时回收BALF。采用血细胞分析仪检测BALF和外周血中EOS的数量。3）大鼠气道形态学检测。在400倍光镜下选择3支具有完整横断面的中小支气管，利用计算机图像分析仪分别测支气管壁内周长（Pi）、基底膜面积（WAi）、气道平滑肌层面积（WAm），并使WAi、WAm与Pi的比值作为标化测量分别代表支气管基底膜厚度（WAi/Pi）和平滑肌层厚度（WAm/Pi）。4）大鼠肺组织miR-21、Eotaxin mRNA检测。取小鼠肺组织样本，剪碎后Trizol提取总RNA，参照试剂盒说明书逆转录为cDNA，以β-actin为内参。引物序列如下；miR-21上游 5'-CCTGCCTGAGCACCTGCTGC-3'，下游 5'-GA CTGTGACGACTACCCCAA-3'；eotaxin上游 5'-TCAC⁃GCTGCAACCCATCTGC-3'，下游 5'-CCAAGGCCAAC CGCGAGAAGATGAC-3'；β-actin上游5'-ACTATCG⁃GCAATGAGCGGTTCC-3'，下游5'-GAGCCACCAATC⁃CACACAGAGT-3'。参照试剂盒说明进行扩增反应，PCR的循环条件：95℃ 30 s预变性，（95℃ 10 s，60℃40 s）×30个循环，得数据以2-ΔΔct计算目标基因的相对表达量。

1.6 统计学处理 应用SPSS25.0统计软件。计量资料以（±s）表示，组间数据比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠一般生理状态 正常组：大鼠毛发光亮，神态安静，动作灵敏，呼吸平稳，饮食正常，大小便正常。模型组：大鼠精神状态较差，随着激发次数增多，呼吸加快、点头样喘息明显，蜷伏不安，皮毛暗黄干涩无光泽、时有脱落，食量下降、体质量增加缓慢的症状。miR-21抑制表达组：大鼠安静少动，毛发稍松散，偶有咳嗽、喘息症状，食欲良好，个别大鼠出现互相撕咬。miR-21抑制表达载体对照组：大鼠活动明显减少或难以行动，反应迟钝，精神状态较差，毛发倒立、无光泽，随着激发次数增多，大鼠出现鼠毛蓬松，食量、体质量下降等症状。miR-21抑制表达+中药组：哮喘激发开始后，大鼠偶可出现搔鼻、咳嗽、喘息等症状。经平喘颗粒治疗后，大鼠上述症状缓解，毛发松散、有光泽，食量较好，体质量增加。中药组：经平喘颗粒治疗后，症状较模型组有所缓解，呼吸逐渐平稳，皮毛有光泽，活动度、食量、体质量逐渐恢复。

2.2 各组大鼠BALF及外周血中细胞EOS计数 见表1。与正常组比较，模型组BALF及外周血中EOS的数量明显升高（P＜0.01），中药组治疗可显著降低BALF及外周血中EOS的数量（P＜0.01）；miR-21抑制表达组数量低于模型组（P＜0.01），与miR-21抑制表达载体对照组比较，miR-21抑制表达组BALF及外周血中EOS的数量明显降低（P＜0.01），miR-21抑制表达+中药组治疗可显著降低BALF及外周血中EOS的数量（P＜0.05或P＜0.01）。

表1 各组大鼠BALF及外周血中细胞EOS计数比较（×105/L，±s）

表1 各组大鼠BALF及外周血中细胞EOS计数比较（×105/L，±s）

注：与正常组比较，##P＜0.01；与模型组比较，**P＜0.01；与miR-21抑制表达组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与miR-21抑制表达载体对照组比较，◇◇P＜0.01。下同。

外周血中EOS计数7.03±3.07 32.66±5.12##31.71±2.58**◇◇32.11±5.60##21.67±4.54△◇◇24.71±3.93##**组别正常组模型组miR-21抑制表达组miR-21抑制表达载体对照组miR-21抑制表达+中药组中药组n 20 20 20 20 20 20 BALF中EOS计数5.79±3.13 33.10±5.61##24.88±5.81**◇◇31.62±4.14##20.90±5.64△△◇◇26.96±5.34##**

2.3 各组大鼠气道形态学变化比较 见表2，图1。与正常组比较，模型组WAi/Pi、WAm/Pi比值明显升高（P＜0.01），中药组可显著降低WAi/Pi、WAm/Pi比值（P＜0.01）；miR-21抑制表达组比值低于模型组（P＜0.01），与miR-21抑制表达载体对照组比较，miR-21抑制表达组WAi/Pi、WAm/Pi比值明显降低（P＜0.01），miR-21抑制表达+中药组治疗均可显著降低WAi/Pi、WAm/Pi比值（P＜0.05或P＜0.01）。

表2 各组大鼠气道形态学变化比较（μm2/μm，±s）

表2 各组大鼠气道形态学变化比较（μm2/μm，±s）

组别正常组模型组miR-21抑制表达组miR-21抑制表达载体对照组miR-21抑制表达+中药组中药组n 20 20 20 20 20 20 WAi/Pi 24.10±5.38 51.17±4.69##39.43±5.39**◇◇50.11±5.32##33.88±7.07△△◇◇42.75±5.60##**WAm/Pi 17.55±5.19 50.65±6.26##39.73±5.62**◇◇51.68±5.50##35.88±4.48△◇◇40.21±4.57##**

图1 各组大鼠肺组织病理变化（HE染色，400倍）

2.4 各组大鼠肺组织miR-21、Eotaxin mRNA表达量比较 见表3。与正常组比较，模型组miR-21、Eotax⁃in mRNA表达量比值明显升高（P＜0.01），中药组治疗可显著降低miR-21、Eotaxin mRNA表达量（P＜0.01）；miR-21抑制表达组表达量低于模型组（P＜0.05或P＜0.01），与miR-21抑制表达载体对照组比较，miR-21抑制表达组miR-21、Eotaxin mRNA表达量明显降低（P＜0.01）；与miR-21抑制表达组比较，miR-21抑制表达+中药组治疗均可显著降低miR-21、Eotaxin mRNA含量（P＜0.05或P＜0.01）。

表3 各组大鼠肺组织miR-21、Eotaxin mRNA表达量比较（±s）

表3 各组大鼠肺组织miR-21、Eotaxin mRNA表达量比较（±s）

组别正常组模型组miR-21抑制表达组miR-21抑制表达载体对照组miR-21抑制表达+中药组中药组n 20 20 20 20 20 20 miR-21/β-actin 1.06±0.20 4.80±0.25##3.22±0.15**◇◇4.87±0.17##1.92±0.15△△◇◇3.50±0.21##**Eotaxin/β-actin 0.39±0.026 1.11±0.072##0.75±0.098*◇◇1.09±0.25##0.54±0.033△◇◇0.64±0.57##**

3 讨 论

《临证指南医案·哮》云“邪散则喘亦止，后不复发……若因根本有亏，肾虚气逆，浊阴上逆而喘者，此不过一二日之间，势必危笃……若夫哮证……邪伏于里，留于肺俞，故频发频止，淹缠岁月”。宿痰伏肺是哮喘发病的基础，肾阳亏虚贯穿发病始终［8］，哮喘病机多虚实夹杂，二者相互影响，叠加复重，导致哮喘迁延难愈，发病关键在于“阳虚痰盛”。治疗用温阳益气、平喘化痰法，依据该法组成温阳益气化痰平喘方，并对该方化裁，制备成平喘颗粒，由淫羊藿、炙麻黄、太子参、黄芪、五味子、款冬花、地龙、罂粟壳、知母组成。方中淫羊藿、炙麻黄为君药，有温阳平喘之功；太子参补气生津，黄芪益气升阳，五味子、款冬花敛肺润肺，地龙配麻黄加强平喘之效，以上5味共为臣药；罂粟壳为佐药，起敛肺止咳之效；知母为使药可以引药归经，润肺止咳，有补虚之用。方中药物合用升降有序，收散并施，使肾阳得补，肺阳得温，痰湿得化，咳喘得消。

近年来研究Micro RNA与哮喘相关性较多，其中miR-21备受关注。有研究指出［9］，哮喘的炎症miR-21表达与哮喘的症状和炎症反应程度呈正相关，可能是控制哮喘重要指标。同时应用miR-21拮抗剂可选择性下调miR-21的表达，降低BALF中细胞总数和嗜酸性粒细胞计数，以及IL-4在内的Th2细胞因子水平，降低气道EOS浸润［10-11］。哮喘是一种气道慢性炎症性疾病，其病理改变为炎性细胞浸润［12］。EOS作为哮喘炎症的最主要标志之一，在哮喘的发病中起重要作用。成熟的EOS由骨髓CD34+祖细胞增殖活化而成［13］，可分泌多种炎症介质，致使平滑肌痉挛和微血管通透性增加［14］，同时大量炎症因子可调节其生成［15］，介导和促进气道炎症产生。Eotaxin为CC亚族趋化因子，为EOS的催化剂，对炎症细胞的活化、聚集起重要作用，使EOS从血液募集到气道上皮，通过释放各种炎症介质致使气道上皮损伤［16］。从查阅相关文献中发现，其三者可能具有相关性，由此猜测miR-21能够调控Eotaxin，从而影响EOS水平，并用实验进行验证。

本研究结果显示，模型组与空白组比较，miR-21、Eotaxin mRNA、BALF及外周血中细胞EOS明显升高，而miR-21抑制表达组以上指标明显降低，提示抑制miRNA的表达可以影响Eotaxin mRNA及BALF及外周血中细胞EOS水平。miR-21抑制表达+中药组与miR-21抑制表达载体对照组比较，miR-21、Eotaxin mRNA、BALF及外周血中细胞EOS明显降低；中药组与模型组比较，以上指标明显降低，提示平喘颗粒可以通过抑制miR-21的表达，降低大鼠肺组织Eotaxin mRNA及BALF及外周血中细胞EOS水平，改善气道形态学变化，从而减轻气道炎症。

综上所述，平喘颗粒能够通过抑制miR-21的表达，降低Eotaxin mRNA表达，从而影响EOS水平，减轻气道炎症，起到治疗哮喘的作用。