加味滋生青阳片对自发性高血压大鼠肾脏的保护作用及机制研究*

李 苏 雍苏南

（湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007）

高血压病是临床较为常见的心血管疾病，易引起心、脑、肾等并发症［1］。目前，高血压病患者仍需终身治疗，防治之路任重道远［2-6］。随着科技的进步、时代的发展，临床中患者不仅要求单纯的血压控制，对于生活质量的追求也越来越高。中医药治疗高血压病有着显著优势，不仅能够控制血压，同时更能改善临床伴随症状，提高患者的生活质量。加味滋生青阳片为全国名中医王行宽教授基于“虚、风、瘀”理论，运用养阴清肝、息风通络法治疗高血压病（肝热血瘀证）的经验方，临床及实验中取得了很好的疗效［7-9］，然而尚缺乏其对自发性高血压大鼠（SHR）肾脏及相关炎症因子影响的研究。本研究以SHR为模型，研究肾动脉组织病理学改变与炎症因子超敏C反应蛋白（hs-CRP）、白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-10（IL-10）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的变化，探讨加味滋生青阳片对SHR肾脏保护作用及机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂 加味滋生青阳片（白芍10 g，生地黄15 g，麦冬10 g，石斛10 g，天麻10 g，石决明20 g，白蒺藜10 g，钩藤15 g，柴胡10 g，桑叶10 g，菊花10 g，薄荷10 g，牡丹皮10 g，川芎10 g；每片相当于原材料16 g，由湖南中医药大学第一附属医院制剂科生产，批号090206，规格0.40 g/片）；替米沙坦片剂（邦坦）（江苏万郑生化医药股份有限公司生产，规格40 mg/片）；血浆高hs-CPR酶联免疫分析测定盒、IL-1β酶联免疫分析测定盒、IL-10酶联免疫分析测定盒、TNF-α酶联免疫分析测定盒（货号19-0308，生产批号20190355）均购自武汉市博士德生物科技公司。

1.2 主要仪器 电子天平TP-2200B（湘仪天平仪器设备有限公司）；海利士4℃冰箱（浙江海利士电器有限公司）；超低温冷冻储存箱（武汉生物科技有限责任公司）；TG16-WS台式高速离心机（湘仪仪器设备有限公司）；CS101-A型电热鼓风干燥箱（重庆实验设备厂）；多功能酶标仪MK-3（湖南中医药大学内科学实验室）；820 Histo stat切片机（Reichert公司）；激光共聚焦显微镜（日本OLYMPUS公司）；MOTIC显微图像摄影系统（麦克奥迪实业集团公司）；数彩图像显微分析系统BTS-20.M（广州华粤行公司）；洗板机（芬兰Thermo Labsystems公司）。

1.3 实验动物 共选用SPF级12周龄雄性大鼠48只，体质量180～220 g，其中WKY大鼠12只，SHR大鼠36只（购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物合格批号：20190120）。饲料购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司。本实验所需动物及饲料均由湖南中医药大学动物实验中心提供，并通过了动物实验伦理审查，受理号：ZYFY20190203。

1.4 分组与给药 36只SHR随机分为模型组、中药组、替米沙坦，每组均为12只。12只相同周龄Wistar大鼠作为空白对照组。所有实验大鼠均给予自由饮食、饮水，连续8周每天上午8点给药，均按1 mL/kg进行灌胃，给药期间密切观察所有实验大鼠的精神、呼吸、饮食、活动力、饮水等状况。按照成人临床用药剂量（以成人体质量为70 kg折算）折合大鼠等效剂量，所有药物用无菌注射用水配置成所需质量浓度。中药组按照3.575 g/（kg·d）给药，替米沙坦组按照4.33 mg/（kg·d）给药。模型组、空白对照组灌胃等体积无菌注射用水。

1.5 标本采集与测定 1）各组大鼠进行尾动脉收缩压测定，测量时间为灌胃前、灌胃第4、6、8周后3 h，记录测量数值。2）各组大鼠第8周灌胃结束后禁食不禁水1 d，水合氯醛麻醉后腹主动脉取血，离心分离血浆，采用ELISA法测定血浆hs-CRP、IL-1β、IL-10、TNF-α含量。3）采血后处死大鼠取肾脏，分离组织后剪取肾动脉于4%多聚甲醛中固定、脱水、浸蜡、包埋及切片、HE染色及脱水，封片及采图用光镜观察肾动脉病理组织改变。

1.6 统计学处理 应用SPSS22.0统计软件。本实验结果均为计量资料，以（±s）表示。各组间样本比较采用方差分析检验、多重比较，若资料不满足正态性、方差齐性，可采用秩和检验或近似检验等方式。P＜0.05可判断为有差异，P＜0.01可认为差异显著。

2 结果

2.1 各组给药前后血压比较 见表1。给药前：模型组、中药组、替米沙坦组血压均高于空白组（P＜0.01）。4周后：中药组、替米沙坦组及空白组血压明显低于模型组（P＜0.05或P＜0.01）；中药组、替米沙坦组较给药前血压明显下降（P＜0.05），但中药组血压与替米沙坦组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；6、8周后：中药组、替米沙坦组及空白组血压均明显低于模型组（P＜0.01）；模型组较给药前血压上升（P＜0.05）；给药前后对比，中药组、替米沙坦组血压在药物干预后明显下降（P＜0.01）。

表1 各组给药前后血压比较（mmHg，±s）

表1 各组给药前后血压比较（mmHg，±s）

注：与空白组比较，◇◇P＜0.01；与模型组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；与本组给药前比较，*P＜0.05，**P＜0.01。下同。

组 别n 给药前 给药4周后 给药6周后 给药8周后空白组模型组中药组替米沙坦组12 12 12 12 120.44±8.76 191.33±10.77◇◇192.26±9.20◇◇192.87±12.85◇◇123.13±7.82▲▲205.46±12.69*181.07±10.44▲*■177.37±9.99▲*121.15±10.77▲▲228.64±10.79*176.48±12.11▲*▲■169.57±11.82▲▲**121.71±8.87▲▲238.61±11.34**165.51±9.37▲▲**■164.47±10.59▲▲**

2.2 各组血浆hs-CRP、IL-1β、IL-10、TNF-α水平比较 见表2。药物灌胃干预8周后，SHR组、替米沙坦组血浆hs-CRP值高于空白组（P＜0.05或P＜0.01），空白组、中药组、替米沙坦组血浆hs-CRP值明显低于SHR组（P＜0.01），但中药组、替米沙坦组组间差异无统计学意义（P＞0.05）。SHR组、替米沙坦组血浆IL-1β均明显高于空白组（P＜0.01），空白组、中药组、替米沙坦组血浆IL-1β均明显低于SHR组（P＜0.01）；而中药组低于替米沙坦组（P＜0.05）。8周后各组血浆IL-10比较，空白组、中药组、替米沙坦组均高于SHR组（P＜0.01）。但中药组、替米沙坦组两组间差异无统计学意义（P＞0.05）。SHR组、替米沙坦组血浆TNF-α均明显高于空白组（P＜0.01），中药组、替米沙坦组、空白组血浆TNF-α均明显低于SHR组（P＜0.01），中药组血浆TNF-α低于替米沙坦组（P＜0.05）。

表2 各组hs-CRP、IL-1β、IL-10、TNF-α含量比较（±s）

表2 各组hs-CRP、IL-1β、IL-10、TNF-α含量比较（±s）

组别空白组模型组中药组替米沙坦组n 12 12 12 12 hs-CRP（μg/L）4.80±0.06▲▲8.40±0.34◇◇5.02±0.26▲▲5.67±0.63◇▲▲IL-1β（ng/L）47.68±1.54▲▲74.64±2.47◇◇54.44±3.34▲▲■60.63±3.18◇◇▲▲IL-10（ng/L）62.77±2.64▲▲41.64±2.15 52.07±1.71▲▲50.65±1.86▲▲TNF-α（ng/L）216.85±12.57▲▲372.19±23.20◇◇231.29±13.32▲▲■256.67±14.57◇◇▲▲

2.3 加味滋生青阳片对SHR肾动脉病理学影响 肉眼观察：各组肾动脉外观无明显变化，在形态及色泽等方面无显著差异。显微镜下观察：空白组肾动脉壁内皮细胞完整，无炎性细胞浸润，弹力纤维明显，平滑肌细胞无水肿；模型组肾动脉壁有不同程度的炎细胞浸润，以黏附为主，内皮细胞局灶性坏死脱落，弹性纤维紊乱，平滑肌细胞排列不整齐，部分平滑肌细胞有水肿；替米沙坦组肾动脉壁有不同程度的炎细胞黏附浸润，以中膜平滑肌浸润为主，内皮细胞完整，弹性纤维排列整齐，平滑肌细胞排列较整齐，无细胞水肿；中药组肾动脉壁少量炎细胞黏附浸润，内皮细胞较完整，弹性纤维排列正常，平滑肌细胞排列清晰。

图1 各组肾动脉病理切片（HE染色，400倍）

3 讨 论

滋生青阳汤出自清代名医费伯雄所著的《医醇义》，全方由生地黄、白芍、麦冬、石斛、天麻、石决明、磁石、桑叶、菊花、牡丹皮、柴胡、薄荷组成。王教授在此方基础上去磁石，加白蒺藜、钩藤、川芎，方中白芍滋养阴血以养肝体，所谓“养其肝血，则其用自平”；石决明、白蒺藜归肝经，平肝潜阳，清肝明目，与白芍同用，刚柔相济，滋养、平潜兼顾，可收阴平阳秘之功，三药共为君药。生地黄、麦冬、石斛协同白芍滋阴以固肝体；天麻、钩藤以加强石决明、白蒺藜之效，同为臣药。桑叶、菊花清肝明目；柴胡、薄荷疏肝解郁，升发青阳，引药入肝，能遂“肝欲散，急食辛以散之”之性，共为佐药。牡丹皮、川芎寒温共济，活血通络同为使药。全方具有养阴清肝、息风通络之功效。现代药理研究证明滋生青阳片组方药物不仅具有一定的降压作用，而且有镇静、抗惊厥、抗氧化、利尿、抗心肌缺血、减慢心率、抗血小板聚集等作用。

高血压病是一个慢性炎症过程，有多种炎症因子参与其发生发展［10］。高血压病在疾病的慢性炎症过程中可激活淋巴细胞系统和单核细胞系统，并产生炎症因子，对交感神经系统、肾素-血管紧张素-醛固酮系统产生影响，从而进行血压调节，损伤血管内皮功能，加速血管重塑过程等［11］。在高血压病发展过程中若某些原因使炎症因素被清除，机体可出现炎症稳态；若某些病因导致炎症因素持续存在，炎症因子水平始终处于异常状态，可使炎症因子持续分泌并且维持在相对较高的水平，机体炎症稳态失衡，最终导致血管内皮功能损伤而发生血管重塑。因此，通过各种手段降低炎症水平，延缓或控制血管重塑已成为高血压病的重要治疗法则之一［12-13］。研究认为，肾脏的炎症浸润是高血压病的一大特征，肾小管间质炎症反应在高血压的发生过程中扮演着重要的角色［14-15］。其影响血压的可能机制是通过影响局部炎症因子的释放而影响肾脏等靶器官血管重塑，导致血压升高。hs-CRP、IL-1β、TNF-α等多种细胞因子共同构成炎症细胞网络，参与多种炎症性疾病的病理过程［16］。研究证明，hs-CRP、IL-1β、TNF-α参与肾脏血管重构的发生发展，其机制可能是它们在肾脏细胞上的异常表达刺激各种生长因子的表达，作用于肾血管平滑肌细胞，加速血管重塑。抗炎因子IL-10是一种具有多种生物学活性的细胞因子，可抑制炎症免疫反应、调节免疫，通过对血管外基质及血管平滑肌细胞的影响，明显抑制血管平滑肌细胞增殖，调节细胞外基质的降解可通过多种途径预防、延缓肾血管重构［17-19］。

前期临床研究表明，滋生青阳片能降低SHR血压，而且能逆转左室肥厚和心肌的超微结构损害，抑制血浆内皮素的产生，降低血浆血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）及醛固酮浓度［8-9］。循环系统和局部组织中AngⅡ水平可在机体处于炎症病理状态时明显增高［20］。而AngⅡ可介导炎症细胞因子的产生和释放，促进炎症反应发生和发展。在本实验中，与相同周龄的空白组大鼠相比，模型组大鼠血压水平不断上升，且其肾动脉壁有不同程度的炎细胞浸润，以黏附为主，内皮细胞局灶性坏死脱落，弹性纤维紊乱，平滑肌细胞排列不整齐，部分平滑肌细胞有明显水肿，并伴随着血浆促炎因子hs-CRP、IL-1β、TNF-α水平升高，抗炎因子IL-10水平下降，表明炎症反应与自发性高血压大鼠的肾动脉血管重塑有着密切关系。实验发现，中药组及替米沙坦组大鼠在药物灌胃干预后血压水平明显下降，且其肾动脉重构现象存在明显改善，同时出现血浆hs-CRP、IL-1β、TNF-α水平降低，而IL-10水平升高。由此我们可以推断，血浆中炎症因子水平对中药组以及替米沙组大鼠的血压下降和改善肾动脉血管重构产生了影响。本实验研究结果表明，中药组加味滋生青阳片在延缓SHR肾动脉血管重塑方面优于替米沙坦，而且可以更好地降低促炎因子IL-1β、TNF-α水平。因此，我们认为加味滋生青阳汤对SHR的肾动脉血管重塑过程具有保护效应，其具体机制可能和其改变血浆炎症因子水平相关。