碱提西番莲叶多糖的分离、鉴定及生物活性

李 霞 刘承鑫 黄 艳 莫观兰 关 媛

(桂林理工大学化学与生物工程学院，广西 桂林 541006)

西番莲(PassifloraedulisSims)含有大量对人体有益的活性物质及矿物元素[1]，其叶被视为一种药材，用于医治失眠、情绪失常和癫痫，有缓解止痛的功效[2]。现有研究表明植物多糖具有降血糖和抗凝活性，Colomeu等[3]研究表明西番莲叶水提物中酚类化合物具有一定糖尿病免疫作用；全娜[4]研究发现枸杞叶多糖显著提高小鼠血清胰岛素的含量，降低血糖的同时也能保护糖尿病小鼠脏器及血清内酶活力；马琳[5]研究得出碱提红枣多糖对APTT值的延长达到水提红枣多糖的11.1倍，说明碱提红枣多糖抗凝效果较好；Francisco等[6]研究表明红藻中的硫酸化多糖不仅具有良好的抗凝血作用，还具备有效的抗血栓形成作用以及抑制血小板聚集的作用。

目前，关于西番莲果皮抗氧化[7-8]、降血压[9]等方面的研究文献较多，但对西番莲叶中多糖组分的体外降血糖和抗凝血活性研究还没有详细的报道。植物多糖除水溶性多糖外，还有大量的胞内多糖或细胞壁结合多糖，热水提取法不能使之溶出，且水提后的残渣通常会被丢弃，而一定浓度碱溶液可以继续提出残渣中的细胞壁结合多糖或胞内多糖[10]。研究拟以热水提取后的西番莲叶残渣为原料，利用碱溶液从残渣中继续提取多糖，对多糖进行测定，并进行体外降血糖和抗凝血活性的研究，以期为西番莲叶中多糖相关药物的研究开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

西番莲叶：桂林万禾农产品有限公司；

NaOH、葡萄糖标准品、无水乙醇、3，5-二硝基水杨酸、无水碳酸钠等：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；

苯酚：分析纯，天津市永大化学试剂有限公司；

考马斯亮蓝：分析纯，合肥博美生物科技有限责任公司；

α-淀粉酶：3.7 U/mg，北京索莱宝科技有限公司；

α-葡萄糖苷酶：酶活25 U/mg，上海源叶生物科技有限公司；

阿卡波糖：杭州中美华东制药有限公司；

肝素钠：北京索莱宝科技有限公司；

活化部分凝血活酶时间测定试剂盒、凝血酶原时间测定试剂盒、凝血酶时间测定试剂盒：上海太阳生物技术有限公司。

1.2 主要仪器与设备

旋转蒸发仪：UV760CRT型，上海贤德实验仪器有限公司；

紫外可见分光光度计：UV760CRT型，上海傲谱分析仪器有限公司；

冷冻干燥仪：ALPHA1-2LD型，德国Martin Christ公司；

离心机：DL-5-B型，上海安亭科学仪器有限公司；

振荡培养箱：LRH-250-Z型，韶关市泰宏医疗器械有限公司；

傅里叶红外光谱仪：IS10型，美国Thermo Fisher公司；

液相色谱仪：LC1220型，安捷伦科技(中国)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 提取与分离 西番莲叶烘干粉碎，用75%的乙醇在85 ℃下冷凝回流提取2 h，提取3次。将醇提后的西番莲叶烘干，按照料液比(m西番莲叶∶V乙醇)1∶16 (g/mL)、100 ℃ 热水提取6 h，将热水提取后的西番莲叶残渣烘干，以料液比(m西番莲叶残渣∶VNaOH)1∶15.6 (g/mL)用6% NaOH浸泡12 h后，60 ℃水浴提取1 h，提取4次，得到西番莲叶的碱提液，浓缩至其1/6体积，冷却，加入3倍体积无水乙醇，4 ℃醇沉48 h，过滤，4 500 r/min离心15 min，蒸馏水复溶，35%盐酸中和，流水透析48 h，冷冻干燥[11]，得到碱提西番莲叶粗多糖(APEL)。将APEL用DEAE-52纤维素柱分离，分别用蒸馏水洗脱出APEL-3、0.7 mol/L NaCl洗脱出APEL-2、0.1 mol/L NaOH溶液洗脱出APEL-1，流速15 mL/min。

1.3.2 多糖主要成分测定

(1) 总糖含量：采用苯酚—硫酸法[12]。

(2) 糖醛酸含量：间羟基联苯法[13]。

(3) 蛋白质含量：考马斯亮蓝法[14]。

(4) 还原糖含量：3,5-二硝基水杨酸法[15]。

1.3.3 红外光谱分析 取适量多糖样品，按照(m多糖∶m溴化钾)1∶100的比例加入干燥的溴化钾晶体，均匀研磨后压片，于4 000～400 cm-1区间用傅里叶红外光谱进行扫描分析。

1.3.4 单糖组成分析 采用高效液相色谱法[16]。将含1 mol/L HCl的无水甲醇(0.5 mL)和多糖样品(2 mg)混合并在80 ℃下水解16 h，然后在120 ℃下用2 mol/L 三氟乙酸(0.5 mL)水解1 h。用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)处理所得的水解产物，并在连接Shimadzu的DIKMA Inertsil ODS-3色谱柱(4.6 mm×150 mm)上进行分析。选用SPD-10AVD UV-VIS检测器。注入PMP衍生物(20 μL)，用82.0% 磷酸盐缓冲液(0.1 mol/L，pH 7.0)和18.0%乙腈(VPBS∶V乙腈)4.5∶1.0的比例以1.0 mL/min 的流速洗脱，并通过245 nm下的紫外光谱(UV)进行监测。

1.3.5 相对分子质量测定 采用凝胶渗透色谱法[17]。色谱条件：配备RI检测器的Tosoh EcoSEC HLC-8320凝胶色谱柱和TSKgel guard PW×l + 2×TSKgel MPW×l + TSKgel G2500PW×l (7.8 mm×300 mm)色谱柱，流动相为0.1 mol/L NaNO3，流速1 mL/min，上样体积100 μL，柱温40 ℃。

1.3.6 体外降血糖活性测定

(1) 对α-淀粉酶的抑制作用：根据文献[18]修改如下，取1 mL不同浓度梯度的样品溶液，加入0.3 mL酶液，并在37 ℃预热20 min，加入0.4 mL淀粉溶液混匀反应5 min，加入1 mL盐酸，0.2 mL碘液摇匀，于660 nm处测量吸光度值A1，用蒸馏水代替酶液测量吸光度值A2，蒸馏水作为空白，吸光度值为A0，以阿卡波糖为阳性对照，按式(1)计算α-淀粉酶清除率。

(1)

式中：

K——α-淀粉酶清除率，%；

A0——蒸馏水代替样品反应后的吸光值；

A1——加入样品反应后的吸光度值；

A2——蒸馏水代替酶液反应后的吸光度值。

(2) 对α-葡萄糖苷酶的抑制作用：取112 μL 0.01 mol/L 磷酸盐缓冲液与0.2 U/mLα-葡萄糖苷酶溶液20 μL混合后加入二甲基亚砜8 μL，然后加入不同浓度梯度的样品溶液50 μL，37 ℃下孵育20 min后加入10 mmol/L 的4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷20 μL，继续孵育20 min，加入0.2 mol/L Na2CO380 μL，在410 nm下测定吸光度值A，并用不加样品(不加样品的以0.01 mol/L 磷酸盐缓冲液代替)测定酶的活力吸光度值A0，以阿卡波糖为阳性对照[19]。按式(2)计算α-葡萄糖苷酶清除率。

(2)

式中：

S——α-葡萄糖苷酶清除率，%；

A0——不加样品测定酶的活力吸光度值；

A——加入样品反应后的吸光度值。

1.3.7 体外抗凝血活性测定 采集新鲜鸡血，将0.109 mol/L 柠檬酸钠溶液与全血按V柠檬酸钠∶V全血=1∶9混合，3 600 r/min离心15 min，取上层血浆。以9%生理盐水为溶剂配制0.10 g/L多糖样品溶液，用9%生理盐水将样品溶液稀释成5，20，50，100 μg/mL的质量浓度梯度。阳性对照：用9%生理盐水配制质量浓度为0.10 g/L 的肝素钠溶液[20]。采用上海太阳生物技术有限公司的试剂盒分别检测活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT)3个抗凝血活性指标。

1.3.8 数据分析 采用Origin 7.0作图和SPSS 17.0软件进行数据统计分析，并采用单因素方差分析(ANOVA)进行显著性差异分析。

2 结果与分析

2.1 多糖成分

如表1所示，APEL、APEL-1、APEL-2和APEL-3总糖质量分数分别为73.80%，81.42%，83.34%，62.93%，糖醛酸质量分数分别为9.38%，4.04%，9.15%，5.59%。APEL经过分离后，APEL-1、APEL-2和APEL-3的蛋白质和还原糖质量分数降低，说明使用DEAE-52纤维素柱分离APEL具有一定的纯化效果，而其中蛋白质质量分数偏高，推测是在碱性条件下蛋白质易溶于溶液中，形成较难去除的高水平蛋白质[21]。

2.2 红外光谱分析

如图1所示，APEL及其各组分均在3 417 cm-1左右有较强的吸收峰，该峰是由多糖中的羟基O—H伸缩振动引起的[22]；在2 927～2 937 cm-1的吸收峰是C—H的伸缩振动，为糖类的特征峰；在1 635～1 639 cm-1附近处的吸收峰是由于C═O伸缩振动引起的[23]，表明含有糖醛酸；在1 400 cm-1附近的吸收峰是由于C—H的变角振动引起的；1 043～1 079 cm-1附近的吸收峰是由C—O的伸缩振动引起的[24]，其中APEL-3的C—O伸缩振动为变角振动。

表1 多糖样品中化学成分和功能性成分质量分数比较

图1 多糖样品的红外光谱图Figure 1 Infrared spectra of polysaccharide samples

2.3 单糖组成成分

如表2所示，APEL由阿拉伯糖、半乳糖醛酸和半乳糖3种单糖组成，以阿拉伯糖为主，其相对质量分数为52.11%。与APEL相比，分离后得到的APEL-1、APEL-2 和APEL-3的单糖组成明显发生变化；APEL-1主要由葡萄糖和木糖组成，其中葡萄糖组分相对质量分数最大为40.53%，木糖相对质量分数达32.36%；APEL-3 主要由阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖组成，同时含有少量的木糖、鼠李糖和葡萄糖醛酸；APEL-2的单糖成分主要为半乳糖醛酸，其相对质量分数为58.63%，其次是阿拉伯糖(18.89%)和半乳糖(12.36%)；在所有的多糖中都能够检测到阿拉伯糖和半乳糖的存在，但其质量分数不同，并且这两种单糖在所有的多糖中占比都比较大。中性多糖APEL-3中阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖质量分数相差不大，在糖链中分布较均匀；而酸性多糖APEL-2的糖链中半乳糖醛酸质量分数相对较高，所以阿拉伯糖和半乳糖质量分数较低。碱提多糖APEL-1中阿拉伯糖和半乳糖含量较低，葡萄糖和木糖质量分数较高，可能是在碱溶液洗脱过程中，各成分之间发生了相互转化或部分产生了降解。

2.4 多糖相对分子质量

碱提西番莲叶多糖及其组分的相对分子质量分布图如图2所示，APEL、APEL-1的相对分子质量分布图中都是单峰，而APEL-2、APEL-3的有多个峰，说明APEL-2和APEL-3中可能存在其他杂质，纯度不高，需要进一步分离纯化。从相对分子质量大小来看，碱提多糖APEL及其组分相对分子质量都比较大，且分布较集中。多糖样品中各峰对应的相对分子质量见表3。

表2 各样品单糖组分的相对质量分数

图2 多糖样品的相对分子质量分布图Figure 2 Relative molecular mass distribution of polysaccharide samples

2.5 体外降血糖活性

2.5.1 对α-淀粉酶的抑制作用 如图3所示，在试验范围内，所有样品对α-淀粉酶抑制效果均随质量浓度的增大而增加，说明各样品对α-淀粉酶的抑制率均存在一定的剂量依赖性。1.0 mg/mL时，APEL-1和APEL-2对α-淀粉酶的抑制率接近阳性对照组(阿卡波糖)的，表明这2种多糖组分对α-淀粉酶的抑制作用较好；碱提西番莲叶多糖及其组分对α-淀粉酶抑制作用强弱顺序为APEL-2>APEL-1>APEL>APEL-3，其中APEL-2对α-淀粉酶的抑制作用最强，最高达到39.21%。

2.5.2 对α-葡萄糖苷酶的抑制作用 如图4所示，随质量浓度的增大，各样品对α-葡萄糖苷酶的抑制活性逐渐升高。与阳性对照相比，碱提西番莲叶多糖及其组分对α-葡萄糖苷酶的抑制活性均低于阿卡波糖，其中APEL-1对α-葡萄糖苷酶的抑制活性最高，为63.89%。APEL经过分离后，APEL-1和APEL-3对α-葡萄糖苷酶的抑制效果均高于分离前多糖APEL，而APEL-2对α-葡萄糖苷酶的抑制能力最低；推测可能与其单糖组成及相对分子质量不同有密切关系[25]。

表3 样品各峰对应的相对分子质量

图3 多糖样品对α-淀粉酶的抑制作用Figure 3 Effects of polysaccharide on α-amylase

图4 多糖样品对α-葡萄糖苷酶的抑制作用Figure 4 Inhibition of α-glucosidase by polysaccharide sample

2.6 体外抗凝血活性

如表4所示，与生理盐水相比，随着质量浓度的增加，碱提西番莲叶多糖及其组分均明显延长了APTT的时间(P<0.05或P<0.01)，且呈剂量依赖性，尤其是APEL，在质量浓度为100 μg/mL时，APEL的APTT凝血时间是生理盐水的4.82倍，说明碱提西番莲叶多糖组分是通过参与内源性凝血途径来发挥抗凝血作用。多糖中的糖醛酸含量会影响其抗凝血效果，糖醛酸含量高，抗凝效果好[26]；在多糖理化性质中，APEL和APEL-2的糖醛酸含量高，而单糖组成分析中这两种多糖的半乳糖醛酸含量都较大，所以APEL和APEL-2相比于生理盐水具有较好的抗凝效果。

如表5所示，与生理盐水相比，质量浓度为5～100 μg/mL 时，所有多糖样品对PT的影响均达到显著性水平(P<0.05或P<0.01)，各多糖样品组对PT时间均有明显延长作用，表明西番莲叶中多糖组分也通过外源性发挥抗凝血效果；其中，APEL-2在0～50 μg/mL时对PT基本没有影响，而100 μg/mL时可以显著延长PT，延长了30.53%。研究表明，当肝素钠分子量在1 000～10 000 Da 时，肝素钠的抗凝血效果较弱[27]；而多糖的分子量也可能影响抗凝功能，分子量过小，无抗凝血能力[28]，APEL、APEL-1、APEL-2和APEL-3均为分子量很大的多糖，所以均具有较好的抗凝血活性。

如表6所示，碱提西番莲叶多糖及其组分对TT也有延长作用，但与肝素钠相比，其增长幅度极小，各多糖样品要达到相同的抗凝血作用则需要更高的浓度，因此推测其可能不是通过共同途径来影响凝血过程。而有研究[29]发现，含有硫酸基的多糖均表现出较好的抗凝血活性；肝素钠本身是一种硫酸氨基葡萄糖钠盐，因此肝素钠会表现出比多糖较好的抗凝血效果。半乳糖是黏附分子凝集素家族识别的配体，与凝集素结合后，阻断了凝集素在血栓形成中的粘附作用，从而达到抗凝血的效果；崔莹莹等[30]发现碱提大蒜多糖组分中的半乳糖构成比例较大，可能是其具有抗凝血活性的原因；单糖组成分析发现碱提西番莲叶多糖组分都存在半乳糖，推测其抗凝血活性可能与半乳糖含量有关。

3 结论

试验结果表明，碱提西番莲叶多糖及其组分具有典型的多糖特征吸收峰，均含有阿拉伯糖和半乳糖，且碱提西番莲叶多糖及其碱洗脱组分为单峰，多糖组分对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶具有抑制作用，主要是多糖链上含有羟基和羧基，可以与消化酶的氨基酸残基结合，从而抑制酶的活性，并且碱提西番莲叶多糖及其组分对α-淀粉酶活性的抑制率大小顺序与糖含量的一致，说明其抑制作用与糖含量呈正相关。抗凝血试验显示，碱提西番莲叶多糖及其组分均显著延长活化部分凝血活酶时间和凝血酶原时间，呈现非常好的抗凝血作用；尤其在质量浓度为100 μg/mL时，碱提西番莲叶多糖及其碱洗脱组分分别显著延长活化部分凝血活酶时间和凝血酶原时间，凝血时间分别达到生理盐水的4.82倍和1.68倍，说明其通过内外源性凝血途径达到抗凝效果。综上所述，碱提西番莲叶多糖明显具有潜在的降血糖和抗凝血作用。后续将进一步探索碱提西番莲叶多糖的体内降血糖和抗凝血活性机制，对其他功能活性如抗血栓等方面进行研究。

表4 多糖样品对APTT的影响†

表5 多糖样品对PT的影响†

表6 多糖样品对TT的影响†