3 个耐寒桑品种不同部位的1-脱氧野尻霉素（DNJ）含量分布

王彬彬，贾漫丽，范伟，李季生，杨贵明，李娜，杨晓东

（河北省高校特产蚕桑应用技术研发中心/承德医学院蚕业研究所，河北 承德 067000）

我国的栽桑养蚕历史迄今已超过6 000 a，有近百万公顷的桑园，桑资源极其丰富。桑树主要含有蛋白质、糖、脂肪、多酚、生物碱等物质[1]，其中1-脱氧野尻霉素（1-deoxynojirimycin，DNJ） 是桑树中一种独有的生物碱，化学名为 （2R，3R，4R，5S） -2-（羟甲基）-3，4，5-三羟基哌啶，分子式为C6H13NO4，相对分子质量为163[2]。DNJ 是一种α-葡萄糖甘酶抑制剂，具有降血糖、抗病毒、抗氧化、抗肿瘤转移等多种生物活性[3～7]。

DNJ 分布在为数不多的几种植物（桑树、风信子、鸭跖草、桔梗科沙属植物等）、部分微生物（浅灰链霉菌、芽孢杆菌等）和昆虫（家蚕、桑蟥、桑螟等）中[8]，而桑树是DNJ 已知来源中含量最高的一种，DNJ 是桑树区别于其他药用植物最具有特色和代表性的次生代谢产物。因此，近年来国内外学者对桑树中的DNJ 分布和含量变化进行了广泛研究，发现桑树的各个部位均含有DNJ，以叶片中含量最多，但其含量易受到桑树品种[9，10]、产地[11]、采摘时期[12，13]和部位[14，15]的影响而出现较大差别。此外，桑叶中的DNJ 含量还受叶位[16]、发育阶段[13]、采收时间[17]和季节[18]的影响。然而，从研究的地域和桑树性状来看，北方抗寒桑树品种DNJ 含量的研究还相对较少。以往研究表明桑树品种间DNJ 含量存在有较大差异，加上南方桑树品种很难在北方越冬，所以无法给北方地区开发桑树药用价值提供较好的树种和原料。在北方冬季低温持续期长，初冬温度骤然下降，早春温度急变以及解冻与复冻持续交替出现，导致桑树发生不同程度的冻害。调查结果显示，桲椤、冀桑2 号和国桑21 号是北方地区 3 个耐寒性好的主栽桑树品种[19，20]。

以北方3 个耐寒桑品种国桑21 号、冀桑2 号和桲椤为研究对象，对枝叶不同部位的DNJ 含量进行测定，以期明确DNJ 在桑树各部位中的消长规律，为北方寒冷地区更有效地开发桑DNJ 资源提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 桑树材料 试验桑树品种为北方地区3 个耐寒桑品种国桑21 号、冀桑2 号和桲椤，均种植于承德医学院蚕业研究所种质资源圃。采样桑树均于2010年栽植，株行距100 cm×200 cm；2018 年4 月进行春伐，8 月25 日选择桑树叶片和枝皮进行DNJ 含量测定。

1.1.1.1 不同叶位的桑叶样品。按田间分布五点采样法，在冀桑2 号和国桑21 号上分别采摘1～4、5～10、11～16、17～25、26～39、40～60 叶位的桑叶，在桲椤上采摘 1～4、5～10、11～16、17～25、26～39 叶位的桑叶，每个采样点各叶位均采摘桑叶20 片。将相同叶位的桑叶样品混合，冷冻干燥后粉碎，过60 目筛，-20 ℃保存，备用。

1.1.1.2 枝条不同部位的桑皮样品。按田间分布五点采样法，在冀桑2 号和桲椤上，分别选取当年生中部枝条的上、中、下3 个部位，每个采样点各部位均选取20 cm 长的枝条样品10 个，剥取新鲜桑皮。将相同部位的样品混合，冷冻干燥后粉碎，过60 目筛，-20 ℃保存，备用。

1.1.1.3 桑叶上不同部位的样品。按田间分布五点采样法，在冀桑2 号中部枝条上采摘完整的叶片10 片，将完整叶片分为叶片（无叶脉）、叶脉和叶柄三部分。将相同部位的新鲜样品混合，冷冻干燥后粉碎，过60目筛，-20 ℃保存，备用。

1.1.2 试剂 1-DNJ 标准品（纯度≥98%）和9-芴甲氧羰酰氯（9-fluorenylmethyl chloroformate，FMOC-Cl，纯度≥99.1%），购自美国Sigma 公司；色谱纯乙腈和甲醇，购自上海阿拉丁生化科技有限公司；甘氨酸（Gly）、醋酸、浓盐酸等其他试剂均为分析纯，国产；HPLC 用水均为双蒸水。

1.1.3 仪器 试验仪器有岛津LC-2030 高效液相色谱系统（日本）、Lab solutions 色谱处理工作站、KS-300EⅡ型超声波清洗机（宁波海曙科生超声设备有限公司）、OHAUS AR224CN 分析天平（奥豪斯仪器有限公司） 和VELOCITY 18R 台式冷冻高速离心机（Dynamica）。

1.2 试验方法

1.2.1 高效液相色谱分析 高效液相分析采用RPHPLC 紫外检测法。高效液相色谱条件：色谱柱为Kromasail-C18 分析柱 （5 μm，4.6 mm×250 mm） 及ODS3预柱（5 μm，4.6 mm×10 mm），流动相为乙腈-0.1%乙酸（体积比40 ∶60），流速1.0 mL/min，柱温25 ℃，紫外检测器激发波长254 nm，进样量20 μL，停止时间60 min。分析软件为Lab solutions 色谱处理工作站，采用外标法计算提取液中的DNJ 含量：

DNJ 含量 （mg/g） =提取液 DNJ 浓度 （μg/mL） ×提取液体积（mL）/样品质量（g）/1 000

1.2.2 标准曲线绘制 精确称取DNJ 标准品6.00 mg，置于100 mL 容量瓶中，加蒸馏水溶解并稀释至刻度，摇匀，制得质量浓度为60 μg/mL 的DNJ 标准品溶液母液。然后，用蒸馏水稀释，依次配制成1、10、20、30、40、50、60 μg/mL 系列梯度浓度的 DNJ 标准品溶液。按照1.2.1 高效液相色谱条件进行上机分析，得到与不同浓度DNJ 标准溶液相对应的色谱峰面积值。

1.2.3 供试样品测定

1.2.3.1 供试样品溶液制备。精确称取待测样品0.25 g 置于50mL 离心管中，加入0.05mol/L 的HCl 溶液25 mL，涡旋混匀2 min，超声波浸提30 min，而后12 000r/min 离心30min，收集上清液；将沉淀用上述方法重复提取1 次。合并2 次得到的上清液，用0.05 mol/L的HCl 溶液定容至50 mL，得到DNJ 的提取液。

1.2.3.2 衍生化处理。取DNJ 对照品溶液或者供试样品提取液200 μL，加入0.4 mol/L 硼酸盐缓冲液（pH值8.5） 338 μL，再加入 5 mmol/L 的 FMOC-Cl/乙腈溶液250 μL，充分混匀，25 ℃反应20 min，然后加入1 mol/L 的甘氨酸水溶液200 μL 终止反应；加入1%乙酸溶液132 μL 和超纯水250 μL，混匀后用注射式0.22 μm 尼龙膜滤器过滤，收集滤液上机分析。

1.3 数据处理与分析

利用SPSS 18.0 软件对数据进行统计学处理，并进行单因素方差分析。若有显著差异，再采用LSD 法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 桑叶样品中检出DNJ 的高效液相色谱

高效液相色谱图（图1～3） 显示，桑叶样品中DNJ-FMOC 的保留时间为5.8 min，并且与其他组分之间有良好的基线分离；试剂中的水解副产物FMOC-OH和Gly-FMOC 与DNJ-FMOC 能良好分离，均不会干扰测定目标成分的准确性。

图1 空白样品的高效液相色谱图Fig.1 HPLC chromatogram of blank samples

图2 DNJ 标准品的高效液相色谱图Fig.2 HPLC chromatogram of DNJ standard samples

图3 桑叶样品中DNJ 的高效液相色谱图Fig.3 HPLC chromatogram of DNJ in mulberry leaves samples

以标准品溶液浓度（X）为自变量、峰面积（Y）为因变量进行线性回归分析（图4），得到回归方程为y=13 156x+5 411.7，相关系数R2=0.999 6。表明DNJ浓度在1～60 μg/mL 范围内，与峰面积呈良好的线性关系。

图4 溶液浓度-峰面积标准曲线Fig.4 Standard curve between solution concentration and peak area

2.2 不同叶位桑叶的DNJ 含量变化

参试品种不同叶位桑叶的DNJ 含量变化趋势基本相同，均随叶位的不断增加而降低（图5～7）。其中，桲椤1～4 叶位桑叶的DNJ 含量为3.711 mg/g，显著＞其他叶位处理；冀桑2 号1～4 叶位桑叶的DNJ 含量为2.453 mg/g，显著＞其他叶位处理，而5 及以上叶位的桑叶DNJ 含量均差异不显著；国桑21 号1～4 叶位桑叶的DNJ 含量为1.877 mg/g，显著＞11 及以上叶位处理，而17 及以上叶位的桑叶DNJ 含量均差异不显著。可以看出，同一品种桑叶DNJ 含量受叶位影响明显，DNJ 含量随叶片成熟度的增高而逐渐降低。

图5 桲椤不同叶位桑叶的DNJ 含量Fig.5 DNJ content of mulberry leaves in different leaves position of Poluo

图6 冀桑2 号不同叶位桑叶的DNJ 含量Fig.6 DNJ content of mulberry leaves in different leaves position of Jisang NO.2

图7 国桑21 号不同叶位桑叶的DNJ 含量Fig.7 DNJ content of mulberry leaves in different leaves position of Guosang NO.21

2.3 桑树不同部位的DNJ 含量变化

参试品种不同部位的DNJ 含量均存在显著差异，其中桑枝皮层的DNJ 含量显著＞桑叶，且桑枝不同部位皮层的DNJ 含量顺序均为上部＜中部＜下部（表1）。表明桑树枝条皮层的DNJ 含量从上向下越来越高，这可能与桑叶、桑枝皮层的生理功能不同有关。

表1 桑树不同部位的DNJ 含量Table 1 DNJ content in different parts of mulberry（mg/g）

从不同品种的各部位DNJ 含量看，桲椤各部位的DNJ 含量均＞冀桑 2 号，其中桑叶的 DNJ 含量高49.0%，桑枝皮层上、中、下部的DNJ 含量分别高66.1%、98.1%和132.2%，差异均非常明显。表明桲椤品种不同部位的DNJ 含量整体高于冀桑2 号，桑枝皮层中的DNJ 含量高于叶片中的含量。

2.4 桑叶不同部位的DNJ 含量变化

冀桑2 号桑叶不同部位的DNJ 含量顺序为叶片＞叶柄＞全叶＞叶脉，但差异均不显著（表2）。

表2 桑叶不同部位的DNJ 含量Table 2 DNJ content in different parts of mulberry leaves （mg/g）

进一步对叶片和叶脉上半部与下半部的DNJ 含量进行分析发现，二者均表现为上半部DNJ 含量＞下半部。因此，预测冀桑2 号叶片的DNJ 含量分布为越靠近上部越高（图4）。分析原因，可能与叶片各部位的生理功能以及防御害虫的功能有关。

图4 桑叶DNJ 含量分布预测图Fig.4 Prediction map of DNJ contents distribution in mulberry leaves

3 结论与讨论

以我国北方地区3 个耐寒桑品种国桑21 号、冀桑 2 号和桲椤为试材，对叶片和和枝皮中的DNJ 含量进行测定，并分析了DNJ 在桑树不同部位以及桑叶不同叶位和不同部位的分布情况。结果显示：

（1）3 个桑品种不同叶位桑叶的DNJ 含量存在显著差异。本试验中将枝条上的桑叶按照1～4、5～10、11～16、17～25、26～39、40～60 分为不同的叶位，测定结果显示，随着叶位（成熟度） 增加，桑叶中的DNJ 含量逐渐减少。这与叶晶晶等[13]、魏兆军等[16]和金超等[21]的“桑叶中1-DNJ 含量均随叶位的增加而逐渐减小，即不同成熟度的桑叶DNJ 含量顺序为嫩叶＞成熟叶＞老叶”研究结果相一致。原因是不同叶位的叶片大小不同，而生长阶段不同植物体内的有机物进入韧皮部后，可向上传输到正在生长的茎枝顶端，即嫩叶或正在成长的果实[22]，因此桑枝上部叶片中的营养物质充足，活性物质含量也相应较高。

（2）桲椤和冀桑2 号桑枝皮中的DNJ 含量较桑叶高且稳定。与耿鹏等[23]、刘卫旗等[15]和陈正收等[24]的相关报道一致。其中，桑枝不同部位皮层的DNJ 含量顺序为上部＜中部＜下部，这可能与桑枝皮层转运的生理功能有关。由桑叶合成的DNJ 可能通过皮层自上而下输送到桑树的各个部位，因此，桑枝下部皮层的DNJ含量相对较高。

（3）冀桑2 号桑叶不同部位的DNJ 含量顺序为叶片＞叶柄＞全叶＞叶脉；并且叶片和叶脉的上半部DNJ含量均高于下半部，与朱见[25]的研究结果一致。我们推测DNJ 可能与叶片的生长有关，DNJ 合成后逐渐扩散到叶脉中，然后进入到叶柄通过韧皮部进而运输到桑树的各个部位。另外，Konno 等[26]研究发现，植物中大多数与防御有关的次生代谢物质都是合成后通过脉管运输的，DNJ 在叶片中的分布规律也证实了这一点。因此，要增加DNJ 含量，提高植物脉管的运输能力可能是一个重要途径。

本试验结果说明，河北传统抗寒桑树品种桲椤桑的DNJ 综合含量较高，其中枝条皮层的含量远大于桑叶，是较好的降糖药用资源。桑树中的DNJ 含量随着其合成、转运、贮存而表现出明显的变化规律，而且往往易受害虫侵害的幼嫩部位DNJ 含量较高，这很可能与其防御害虫的功能有关。至于DNJ 与防御机制之间的具体联系，还需进一步探明，从而为桑树的进一步开发利用提供更为可靠的依据。