辐照对川芎等中药材有效成分提取的影响

张晓彬，倪茂君，王静霞，彭朝荣，陈竹平

(四川省原子能研究院 辐照保藏四川省重点实验室，成都 610101)

目前中药提取方法多采用传统溶剂提取法，有效成分损失较多，尤其是水不溶性成分；提取过程中有机溶剂可能与有效成分作用，使其失去原有活性；非有效成分不能被最大限度地除去，浓缩度不够；提取液中除有效成分外，杂质较多；高温操作引起热敏性有效成分的大量分解等[1]。特别是随着中药材使用量的增大，中药材品质参差不齐，同样造成提取效率低，品质差。发展中草药先进提取技术是中草药提取的重点发展方向。

辐照技术是以高能射线照射为物质提供高能量离子，使物质产生降解或化学反应，具有常温操作、环保无污染、穿透性好等优点，与中药材炮制有异曲同工之处。目前已证明其安全性，并广泛用于中药材辐照灭菌，而研究表明，辐照可提高绿茶中茶多酚含量，提高抗氧化活性，减小气味和颜色[2]；龙金花等[3]研究发现，与常规水提取法、溶剂提取法相比，辐照预处理辅助提取五倍子单宁酸的得率分别提高了15.13%和20.13%。与中药材辐照灭菌应用相比，高能射线辐照在中药材其他方面的应用研究相对较少[4-9]。根据辐照技术特点及中药材有效成分多样性和化学组成特殊性，将辐照技术作为新能源和新方法应用于中药材有效成分提取、品质提升等领域可提高经济效益，促进中药材、中药企业现代化发展，具有巨大的经济和社会价值。

根据卫生部发部的《60Co辐照中药灭菌剂量标准》[卫药发1997第38号]，国家科委“七五”公关项目“60Co-γ射线辐照中药质量评价研究”、国家科委“八五”公关项目“60Co辐照中药灭菌剂量标准的应用研究”，中药辐照灭菌多使用的最大吸收剂量为6 kGy,对于紫苑、锦灯笼、乳香、天竺黄、补骨脂辐照灭菌时最大吸收剂量不超过3 kGy，含有龙胆苦苷的秦摎和龙胆不得辐照灭菌。本文选取人参、黄连、黄芪、川芎、天麻、丹参6种中药材，在中药材常规提取的基础上，研究辐照辅助处理对中药材有效成分提取率的影响，筛选可用于辐照辅助提取的中药品种及有效成分，为进一步分离、纯化提供数据支撑，为辐照加工技术在中药材提取领域的应用提供参考。

1 材料与仪器

1.1 主要仪器与装置

高效液相色谱仪(HPLC)：UltiMate3000，美国Dionex公司；紫外分光光度计：Evolution 220，美国Thermo Scientific公司；数控超声波清洗器：KH2200DE型，功率100 W，昆山禾创超声仪器有限公司。

1.2 主要材料与试剂

人参、黄连、黄芪、川芎、天麻、丹参：均为大宗药材，其中川芎、天麻、黄连、丹参均为四川产道地药材，购自太极大药房，药材打粉后过40目筛备用；中草药提取物对照品：提取物标准品，成都曼斯特生物科技有限公司；乙醇、甲醇：分析纯，成都市科龙化工试剂厂；超纯水：18.25 MΩ·cm，实验室自制。

2 实验方法

将中药材粉末材料分装为每份10 g，送至四川省原子能研究院辐照工程中心，分别使用60Co-γ射线辐射装置和GJ-2工业电子加速器(2 MeV，20 kW)进行辐照处理，吸收剂量为5、15、30 kGy。处理后对不同药材有效成分进行提取与检测。

2.1 川芎

取未辐照、60Co-γ射线及电子束辐照后的芎粉末0.5 g，精密称定，置50 mL细口丝口瓶中，加入70%甲醇50 mL，50 ℃加热超声提取30 min，冷却后再称定重量，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀静置，取上清液，用0.22 μm滤膜过滤，取滤液送液相色谱检测。对照品为阿魏酸，检测柱为C18柱(4.6 mm×250 mm×5 μm)，以甲醇-1%醋酸溶液(30∶70)为流动相，检测波长321 nm，进样量10 μL。按公式(1)计算相对提取率：

相对提取率=Yi/Y0×100%

(1)

其中，Yi为不同处理条件提取量，Y0为未处理样品提取量。

2.2 天麻

取未辐照、60Co-γ射线及电子束辐照后的天麻粉末2 g，精密称定，置50 mL细口丝口瓶中，精密加入70%乙醇50 mL，搅拌并称定重量，50 ℃超声提取2 h，冷却，再称定重量，用70%乙醇补足减失的重量。天麻提取液用0.22 μm的针头过滤器过滤，取续滤液约12 mL送液相检测。对照品为天麻素，检测柱为C18柱(4.6 mm×250 mm×5 μm)，以乙腈-0.05%磷酸溶液(3∶97)为流动相，检测波长220 nm，进样量10 μL。按公式(1)计算相对提取率。

2.3 丹参

取未辐照、60Co-γ射线及电子束辐照后丹参粉末，精密称量0.3 g，置50 mL细口丝口瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定重量，超声提取30 min，冷却后再称定重量，用甲醇补足减失的重量，补足后的提取液送液相色谱检测。色谱柱选用C18色谱柱(4.6 mm×250 mm×5 μm)，二元线性梯度洗脱，流动相为乙腈(A)和0.02%磷酸水溶液(B)；洗脱梯度如下：0～20 min(80%B)，20～50 min(20%B)，50～55 min(80%B)，柱温25 ℃，流速0.4 mL/min；进样量5 μL。按公式(1)计算相对提取率。

2.4 人参

取未辐照、60Co-γ射线辐照后的人参粉末，精密称取1 g上述人参粉末样品，加入70%乙醇15倍量，超声提取3次，每次1 h，合并提取液，滤过，滤液用70%乙醇定容至50 mL，过0.22 μm滤膜，作为样品溶液进行高效液相色谱检测。色谱柱为 C18柱(4.6 mm×250 mm×5 μm)，柱温25 ℃；二元线性梯度洗脱，流动相为乙腈(A)和蒸馏水(B)；洗脱梯度如下：0～18 min(85%B)，18～28 min(77%B)，28～47 min(70%B)，47～52(56%B)，52～69 min(32%B)，69～84 min(0%B)，84～89 min(85%B)；柱温25 ℃，流速1.0 mL/min；进样量5 μL。

以紫外分光光度法检测人参总皂苷含量，按公式(1)计算相对提取率。

2.5 黄连

取未辐照、60Co-γ射线及电子束辐照后的天麻粉末0.2 g，精密称定，置50 mL细口丝口瓶中，加入甲醇-盐酸(100∶1)的混合溶液20 mL，密塞，称定重量，超声提取30 min，冷却后称定重量，用甲醇补足减失的重量。色谱柱选用C18色谱柱(4.6 mm×250 mm×5 μm)，流动相为乙腈-0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液(30∶70)，检测波长345 nm；流速0.7 mL/min，进样量10 μL。按公式(1)计算相对提取率。

2.6 黄芪

取未辐照、60Co-γ射线及电子束辐照后的黄芪粉5 g，加入8倍量pH为9的氧化钙碱性水溶液和5%的乙醇，称重后于50 ℃超声提取30 min，过滤收集滤液，重复提取，合并2次滤液，提取液经浓缩后，90%乙醇沉淀，离心收集多糖，上清液经浓缩后二次沉淀，合并多糖，干燥得黄芪粗多糖。

按以下公式计算粗多糖得率：

粗多糖得率=粗多糖含量/黄芪粉含量×100%

(2)

取0.1 g粗多糖，定容至10 mL，配置成1%浓度的黄芪多糖溶液，按苯酚硫酸法测定提取液中黄芪多糖含量，检测波长490 nm。

2 结果与讨论

考察不同辐照源及吸收剂量对中草药有效成分的影响，选取60Co及电子加速器两种辐照源，参照《60Co辐照中药灭菌剂量标准》，中药辐照灭菌多使用的最大吸收剂量为6 kGy，选择5 kGy辐照组作为对照，15 kGy、30 kGy、40 kGy辐照组为吸收提取实验剂量。

2.1 辐照对川芎有效成分的影响

阿魏酸是川芎中有机酸类主要有效成分，约占生药含量的0.1%～0.2%，阿魏酸及其衍生物可抑制血小板聚集，抗血栓形成，抗炎止痛等，辐照对阿魏酸的影响示于图1。从图1中可以看出，辐照源对阿魏酸含量的影响有较大差异。随着吸收剂量的增加，不同辐照源下阿魏酸含量呈现逐渐降低的趋势。60Co-γ射线辐照下阿魏酸含量和提取率明显高于电子加速器辐照，采用60Co-γ辐照，阿魏酸分解率较低，15 kGy情况下仅减少4.18%；电子加速器辐照下，阿魏酸在5 kGy辐照时即快速分解，30 kGy时提取率为未辐照时的92.60%，含量减少7.7%。

A—未辐照；B—60Co-γ辐照5 kGy；C—15 kGy；D—30 kGy；E—电子加速器辐照5 kGy；F—15 kGy；G—30 kGy

取液高效液相色谱图及阿魏酸结构示于图2。从图2中可以看出，辐照处理后，色谱图中主要出峰时间及峰面积无明显差异，表明阿魏酸结构无明显改变。其提取含量降低可能是由于分子结构中含有活性羟基、羧基及双键等官能团，在不同能量作用下部分分子结构发生化学反应造成的，瞬时能量越高，反应越大，因此不同辐照源辐照辅助处理后提取率差异较大。

2.2 辐照对天麻有效成分的影响

中药天麻的主要有效成分为天麻素，具有较好的镇静和安眠作用，对神经衰弱、失眠、头痛症状有缓解作用。辐照辅助处理对天麻有效成分提取的影响列于表1。从表1中可以看出，60Co-γ射线辐照与电子加速器辐照结果一致，均随着吸收剂量的增加逐渐减少，二者无显著差异。这一结果可能与天麻素分子结构有关。

表1 辐照对天麻有效成分的影响

天麻提取液高效液相色谱图及天麻素结构示于图3。从图3中可以看出，不同辐照处理后，天麻提取液液相色谱图无明显差异，表明辐照对天麻提取液中物质结构无明显改变。天麻素分子中含有大量羟基及醚键，但分子结构中含有较稳定的环状结构，因此，随着辐射剂量增大，可能导致其分子中醚键发生断裂，从而使天麻素检测含量降低。

A—未辐照；B—60Co-γ辐照5 kGy；C—15 kGy；D—30 kGy；E—电子加速器辐照5 kGy；F—15 kGy；G—30 kGy

2.3 辐照对丹参有效成分的影响

丹参主要活性成分包括脂溶性成分(丹参酮类、丹参内酯等)和水溶性成分(丹参素、丹酚酸等)，甲醇提取获得的有效成分以酮类为主，总丹参酮有抗菌、消炎、活血化瘀、促进伤口愈合等多方面作用。辐照对丹参脂溶性成分的影响列于表2。从表2中可以看出，在30 kGy以内辐照处理后，丹参脂溶性成分均出现先减小后增大的趋势。不同辐照源中，60Co-γ辐照对丹参脂溶性成分影响较大：电子加速器辐照30 kGy隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA分别减少3.32%、4.57%和4.05%，而60Co-γ辐照30 kGy后分别减少8.86%、5.14%和3.85%。丹参酮ⅡA相对其他脂溶性成分变化率较小，这可能与其相对稳定的结构有关。

表2 辐照对丹参脂溶性有效成分的影响

丹参提取液高效液相色谱图及丹参酮类结构示于图4。从图4中可以看出，辐照辅助处理后丹参提取液色谱图无明显变化，表明其主要成分结构无明显改变。从脂溶性丹参酮结构中可以看出，丹参酮为菲醌类化合物，分子骨架中发生共轭形成大π键，丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA和隐丹参酮分子共轭体系依次缩小，从而导致其辐射效应的不同。

A—未辐照；B—60Co-γ辐照5 kGy；C—15 kGy；D—30 kGy；E—电子加速器辐照5 kGy；F—15 kGy；G—30 kGy

2.4 辐照对人参有效成分的影响

不同人参皂苷液相检测结果示于图5。从图5中可以看出，辐照对不同人参皂苷的影响具有显著差异。其中，随吸收剂量增加，人参三醇皂苷Re含量分别降低0.9%、9.74%和25.34%；而Rg2变化率则为-8.15%，18.77%和4.48%，当吸收剂量为15 kGy时具有较大值。人参二醇皂苷中，人参皂苷Rb1的含量随着吸收剂量的增加，呈逐渐上升趋势，15 kGy有最大值4.17 mg/g；Rg3含量先减小后增大，15 kGy有最大值；而Rd则分别降低0%，5.75%和16.52%。造成这一结果的原因可能是人参皂苷种类繁多，因此在辐照过程，皂苷的降解造成总皂苷含量降低，但也有可能形成部分皂苷间的相互转化，从而提高某种皂苷含量。

图5 辐照对人参皂苷成分含量的影响

辐照对人参总皂苷提取得率的影响列于表3。从表3中可以看出，随着吸收剂量增大，人参总皂苷含量逐渐降低，辐照易造成人参皂苷结构的改变和降解。人参皂苷都具有相似的基本结构，都含有由30个碳原子排列成四个环的甾烷类固醇核。依糖苷基架构的不同而被分为两组：达玛烷型和齐墩果烷型。达玛烷类型包括两类：人参二醇型-A型，苷原为20(S)-原人参二醇。包含了最多的人参皂苷，如人参皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Rg3、Rh2及糖苷基PD；人参三醇型-B型，苷原为20(S)-原人参三醇。包含了人参皂苷Re、Rg1、Rg2、Rh1及糖苷基PT。

表3 辐照对人参总皂苷的影响

2.5 辐照对提取黄连有效成分的影响

黄连中主要有效成分为生物碱类，辐照对黄连中盐酸巴马汀和盐酸小檗碱提取得率的影响列于表4。从表4中可以看出，辐照源对黄连中有效成分的影响具有明显差异。60Co-γ射线辐照后，盐酸巴马汀及盐酸小檗碱含量均随着辐照剂量增加而先降低后增加，在15 kGy剂量下有最小值。而电子加速辐照后，5 kGy剂量下有效成分提取得率较低，随着剂量增大，有效成分含量逐渐增大。

表4 辐照对黄连有效成分的影响

辐照对黄连有效成分提取率的影响示于图6。由图6可知，5 kGy电子束辐照后盐酸巴马汀与盐酸小檗碱含量分别降低10.68%和7.87%，但增大吸收剂量至40 kGy后，黄连中盐酸小檗碱含量提高2.29%，而盐酸巴马汀含量与未辐照相比降低1.68%。这一结果可能是由于黄连中具有较多纤维素及木质素，木质素以辐照交联为主[10]，纤维素易于辐照裂解。低剂量辐照下，主要有效成分在提取过程中不易溶出，木质素快速交联导致溶出降低；随着剂量增大，纤维素降解增大，有效成分溶出增大，提取率则相对增大。

图6 辐照对黄连有效成分提取率的影响

黄连提取液高效液相色谱图示于图7，本研究考察了盐酸小檗碱及盐酸巴马汀这两种生物碱成分。从结构上可以看出，小檗碱及巴马汀为异喹啉生物碱，骨架结构能够耐受高辐射剂量。两种生物碱的辐解反应虽然较难发生，但受到低剂量下木质素辐照交联相对分子质量快速提高的限制，溶出能力受阻，因此高剂量辐照有利于黄连有效成分的溶出和提取率的提高。

A—未辐照(A)；B—60Co-γ辐照5 kGy；C—15 kGy；D—30 kGy(D)；E—电子加速器辐照5 kGy；F—15 kGy；G—30 kGy

2.6 辐照对黄芪有效成分的影响

黄芪多糖是黄芪主要有效成分之一，具有提高免疫力、抗氧化、抗癌、抗衰老等多重功效，应用较广。黄芪经不同辐射源及辐射剂量处理后，其提取液黄芪多糖含量与粗多糖提取得率示于图8。从图8中可以看出，不同辐照源下，黄芪粗多糖得率均随着吸收剂量增大逐渐增大，电子加速器辐照(E/F/G)提取得率均大于60Co-γ辐照(B/C/D)；粗多糖中黄芪多糖含量均随着吸收剂量增加先增大后减小，电子加速器辐照15 kGy具有极大值，明显优于60Co-γ辐照(B/C/D)。从图中还可看出，剂量越高，粗多糖得率越高，但多糖含量越低，纯度较低。造成这一结果的原因可能是，一方面黄芪多糖、纤维素等大分子均在高能量作用下产生降解，从而使提取过程中纤维素易于溶胀，黄芪多糖分子易于溶出，提取得率增大，但黄芪多糖分子量分布宽，随着剂量增大，降解过程中小分子进一步降解成单糖或寡糖去除，失去生物活性，因此含量随着吸收剂量增大而先增大后减小；另一方面，纤维素降解有利于多糖溶出，同时也有利于其他杂质分子的溶出，造成杂质含量增大，多糖纯度降低，给后续纯化造成难度。因此适宜的辐照工艺为电子加速器辐照15 kGy，该条件下黄芪多糖提取率和纯度均较高。

A—未辐照(A)；B—60Co-γ辐照5 kGy；C—15 kGy；D—30 kGy(D)；E—电子加速器辐照5 kGy；F—15 kGy；G—30 kGy

2.7 辐照前后中药材有效成分的变化

表5汇总了辐照对6种中药材各种有效成分的影响，从表5中可以看到黄连的有效成分盐酸巴马汀、盐酸小檗碱，丹参中的脂溶性成分隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA在辐照中药灭菌剂量标准规定的剂量下，有效成分含量改变不大；天麻、川芎等有效成分在辐照过程中易产生化学反应，有效成分含量降低，通过实验表明这两种中药不适用于辐照辅助提取；黄芪经辐照处理后，提取过程中纤维素溶胀增大，在标准规定的剂量范围内，5 kGy辐照组相对于未辐照组提取率提高17.59%，黄芪可以采用辐照辅助提取，提高黄芪多糖提取率。

表5 辐照对中药材有效成分的影响

3 结论

(1)黄芪经辐照处理后，其纤维素和多糖分子降解，提取过程中纤维素溶胀增大，多糖提取率提高，电子加速器优于γ射线，最佳条件为电子束辐照15 kGy。该方法辐照工艺简便，提取率高，有利于促进黄芪多糖提取工艺的进步，具有较大的应用前景。

(2)中药材有效成分结构对其辐照稳定性具有较大的影响。黄连、丹参等有效成分具有较稳定结构，低剂量下有效成分含量改变不大，高剂量下，纤维素降解，有利于有效成分的溶出，从而提高提取得率；而天麻、川芎等有效成分分子结构中含有较多活性官能团，在辐照过程中易产生化学反应，造成结构改变或降解，有效成分含量降低。根据中药材有效成分结构与反应活性，对中药材辐照灭菌过程中的有效成分及药理药效研究具有重要的参考价值。

(3)辐照会造成人参皂苷化学键断裂，从而造成人参皂苷含量降低；但在一定剂量下，可能促进不同人参皂苷间的转化，从而使某类皂苷含量提高，对人参皂苷的研究具有重要意义。

(4)中药材辐照不仅能够起到灭菌的作用，通过辐照辅助提取考察中药材有效成分的变化，筛选可用于辐照提取的中药材及有效成分，为辐照加工技术在中药材提取领域的应用提供研究基础。