猪圆环病毒2 型和3 型双重荧光PCR检测方法建立及应用
2021-04-08翟少伦娄亚坤杜丽银温肖会翟颀周秀蓉贾春玲霍玮陈美霞杨燕秋吴国景吕殿红
翟少伦，娄亚坤，杜丽银，温肖会，翟颀，周秀蓉，贾春玲，霍玮，陈美霞，杨燕秋，吴国景，吕殿红
（1.广东省农业科学院动物卫生研究所/ 广东省畜禽疫病防治研究重点实验室/ 农业农村部兽用药物与诊断技术广东科学观测实验站广州 510640；2.郑州中道生物技术有限公司郑州 450000；3.紫金县动物疫病预防控制中心广东河源 517400）
猪圆环病毒（porcinecircovirus，PCV）属于圆环病毒科（Circoviridae）圆环病毒属（Circovirus），目前基因型分为PCV1、PCV2、PCV3 和PCV4[1,2]。其中PCV1 对猪无致病性，PCV2 是目前已知的最小脊椎动物病毒之一，基因组大小约为1.7kb，包含2个主要的开放阅读框，ORF1 和ORF2 分别编码复制酶（Re p）和衣壳蛋白（Ca p）。PCV2 自从被发现以来，相继在世界各地暴发流行，主要感染家猪和野猪，可引起母猪繁殖障碍、断奶仔猪多系统衰竭综合征、猪皮炎肾病综合征、猪呼吸道疾病综合征、坏死性淋巴结炎、渗出性皮炎等一系列疾病，且PCV2 感染后可引起免疫细胞损伤，导致机体免疫力下降，具有养猪业的“隐形杀手”之称，使全球养猪业遭受了巨大的经济损失。
PCV3 是PCV 的一种新基因型，2015 年在美国北卡罗来纳州发生猪皮炎肾病综合征和繁殖障碍的猪场中最先发现，之后有报道称PCV3 与心肌炎和肾小球肾炎有关[3,4]。该病毒全基因组大小为2kb，结构与PCV2 类似，包括Rep和Cap两个主要蛋白，但与PCV2Cap蛋白的同源性较低，约为30%。2017 年湖北、广东、安徽等多个省份的猪场陆续检测到PCV3 感染猪群的现象，虽然不同地区PCV3 全基因组存在差异，但同源性较高。PCV3 感染可能导致猪群发生如皮炎和肾病综合征、断奶仔猪多系统衰竭综合征、仔猪先天性震颤等一系列相关疾病。同时在研究中发现，猪群中存在PCV2 和PCV3 混合感染的情况，且混合情况较为严重。PCV4 在我国湖南猪群中发现，目前的检测数据显示，其流行率较低，且与猪病的相关性还不明朗[2,5,6]。
鉴于PCV2 和PCV3 在临床上的混合感染以及高度相似的临床特征，因此加强PCV2 和PCV3 的鉴别诊断对猪圆环病毒病的防控尤为重要，且建立一种快速、可靠的同时检测PCV2 和PCV3的方法对于猪圆环病毒病的临床诊断和流行病学调查意义重大。
1 引物和探针设计
通过比对GenBank上收录的PCV2基因序列，确定保守序列，并针对该区域设计特异性的引物探针，用于检测PCV2。经过大量设计并筛选出PCV2-F1 和PCV2-R1 为上下游引物，PCV2-P1为探针，所述引物组和探针的核苷酸序列分别为：
PCV2-F1：5'-AYAACAAAAGRAATCAG(A)C-3'；
PCV2-R1：5'-TGTACATACATGGTTACACG-3'；
PCV2-P1：5'-FAM-TACGACCAGGAMTACA-BHQ1-3'。
通过比对GenBank上收录的PCV3基因序列，确定保守序列，并针对该区域设计特异性的引物探针，用于检测PCV3。经过大量设计并筛选出PCV3-F2 和PCV3-R2 为上下游引物，PCV3-P2为探针，所述引物组和探针的核苷酸序列分别为：
PCV3-F2：5'-TGGCTCAACACATATGAC-3'；
PCV3-R2：5'-ACGGACTTGTAACGAATC-3'；
PCV3-P2：5'-HEX-TGCCGTAGAAGTCTGTCATTCCA-BHQ 1-3'。
2 阳性质粒构建
人工合成PCV2 靶基因序列（Ge nBa nk 登录号：KT719404）和PCV3 靶基因序列（Ge nBa nk 登录号：MK580466），两端基因均连接至载体上，将重组的载体DNA 作为阳性质粒，进行PCR 扩增。
3 PCR体系及反应条件优化
以制备的阳性质粒，用引物组PCV2-F1、PCV2-R1和PCV3-F2、PCV3-R2，探针PCV2-P1和PCV3-P2在最优扩增条件下对稀释好的质粒标准品进行荧光PCR扩增，扩增体系为：PCV2-F10.166μL，PCV2-R10.211μL，PCV2-P10.203μL，PCV3-F20.190μL，PCV3-R20.188μL，PCV3-P20.247μL，Fast-FireqPCRPreMix12.5μL，DNA模板5μL，ddH2O补足25μL。扩增程序为：95℃，3min；95℃变性15s，55℃退火延伸3s，循环40次，收集荧光信号，PCV2选择FAM通道和PCV3选择HEX通道，获得扩增曲线。
4 PCR特异性试验
分别提取DNA 或RNA，制备猪细小病毒DNA 基因组、猪伪狂犬病毒DNA 基因组、猪瘟病毒c DNA 全基因组、猪繁殖与呼吸综合征病毒c DNA 全基因组、猪流行性腹泻病毒c DNA 全基因组、猪健康组织（血液、皮肤组织）DNA 基因组作为特异性质控品，并分别作为模板进行荧光PCR 检测，按体系配制试剂和设置反应程序。结果显示，检测结果均为阴性，本试剂盒特异性良好。
5 PCR敏感性试验
用紫外吸收法测重组质粒的浓度，先调整重组质粒的浓度至104c op ie s/μL，用d d H2O 对阳性质粒进行10 倍倍比稀释，稀释范围为10-1～10-4，分别作为模板进行PCR 检测。按反应体系配制试剂和设置反应程序。结果显示，本试剂盒的最低检出限为10copies/μL，表明本试剂盒有较高的灵敏度，如图1。
图1 PCR 灵敏度试验结果
6 PCR结果判定
6.1 试验有效性判定
阳性对照在FAM 和HEX 通道均有典型扩增曲线且Ct 值≤30，且阴性对照在FAM 和HEX通道均无Ct 值、无扩增曲线，则判试验结果有效；否则，此次试验视为无效。
6.2 样品判定
1）待检样品仅FAM 通道出现典型扩增曲线且Ct 值≤38，判定为PCV2 核酸阳性；若38＜Ct 值≤40 判定为可疑，建议重复检测，检测结果仍然为Ct 值≤40 则判为阳性。无扩增曲线且无Ct值，判为阴性；
2）待检样品仅HEX通道出现典型扩增曲线且Ct 值≤38，判定为PCV3 核酸阳性；若38＜Ct 值≤40 判定为可疑，建议重复检测，检测结果仍然为Ct 值≤40 则判为阳性。无扩增曲线且无Ct值，判为阴性。
7 PCR临床应用
取实验室用单重商品化荧光PCR 检测试剂盒鉴定为PCV2或PCV3 核酸阳性的样品30 份，分别用本研究建立的PCV2 和PCV3 双重荧光PCR 检测方法检测，结果与商品化荧光PCR 检测试剂盒检测结果一致，表明该双重荧光PCR 检测方法具有更好的集成性和灵敏性。
8 小结与讨论
本研究根据PCV2 和PCV3 临床上混合感染的情况，设计了特异性的引物和探针，建立了PCV2 和PCV3 二重荧光PCR 检测方法。该方法比传统的普通PCR 方法、单重荧光PCR 方法更具有高通量性，适合第三方兽医检测实验室对大量样品开展检测。
