磁珠法和柱式法提取核酸在新城疫荧光定量检测中的比较

王军，何长生，王维，王倩，周迎春

（安徽省动物疫病预防与控制中心合肥 230091）

新城疫（newcastle disease，ND）是由新城疫病毒（newcastle disease virus，NDV）强毒株引起的、以感染禽类为主的一种急性、热性、败血性和高度接触性传染病[1]，具有很高的发病率和死亡率，在全球范围内广泛流行，曾在世界范围内引起三次大的流行，给养禽业造成了巨大的经济损失，严重影响了养禽业的发展，该病与高致病性禽流感并列为世界公认的最重要的2 个禽类疫病[2,3]。世界动物卫生组织（OIE）将新城疫列为A 类疫病，我国将其列入一类动物疫病[4]。

目前检测新城疫病毒的常用方法为荧光定量RT-PCR，该方法比常规的检测方法用时少、周期短、灵敏、准确、特异性强、操作简便[5]，且不易引起污染，还可用于病毒的定量分析。在检测过程中，提取核酸是关键环节，因为提取后的核酸质量及其完整性会直接影响到后续试验结果[6]。本研究选用实验室常用的磁珠法和柱式法提取病毒核酸进行荧光定量RT-PCR 检测，发现两种提取方法在灵敏度及重复性等方面存在差异。现将研究结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要仪器与设备King Fisher Flex 96 通道全自动核酸提取仪，微量移液器，MIKRO 200R 高速冷冻离心机，BIO-RAD CFX Connect 荧光定量PCR 仪。

1.1.2 检测试剂新城疫病毒荧光RT-PCR 试剂盒，购自深圳澳东检验检测科技有限公司，批号：66080；病毒核酸（RNA）抽提试剂盒（离心柱式），购自深圳澳东检验检测科技有限公司，批号：69015；病毒核酸提取试剂（磁珠法），购自广州和实生物技术有限公司，批号：CZD00412。

1.1.3 样品2020 年主要禽病流行病学调查及监测中，筛查出的新城疫阳性样品（鸡咽泄拭子和环境拭子），共22 份。

1.2 方法

1.2.1 磁珠法将拭子样品混匀，静置3～5min，取200μL上清，由King Fisher Flex 96 通道全自动核酸提取仪提取核酸，最后获得100μLRNA 溶液。

1.2.2 柱式法将拭子样品混匀，静置3～5min，取100μL上清到1.5mL洁净离心管中，加入200μL裂解液、3μLCa rrie r RNA，涡旋混匀20s，室温静置5min，然后加入150μL无水乙醇，颠倒混匀，短暂低速离心除去管盖上的液体，小心将混合液体转移至纯化柱管内，12,000rp m 离心1min，倒弃废液收集管内液体。打开管盖，加入450μL洗液1，12,000rp m 离心1min，倒弃废液收集管内液体；打开管盖，加入500μL洗液2，12,000rp m 离心1min，倒弃废液收集管内液体；再加入500μL无水乙醇，12,000rp m 离心1min，倒弃废液收集管内液体，再于12,000rp m 离心3min，丢弃废液收集管。将纯化柱取出放进1.5mL洁净的离心管中，打开管盖，室温干燥3min 后，向膜片中央小心加入50μL 洗脱液，室温放置1min，12,000rp m 离心1min，最后获得50μLRNA 溶液。

1.2.3 荧光RT-PCR 法PCR 各个组分所需要的量，按（n+1）公式计算，然后分别吸取混入同一灭菌1.5mL进口离心管中，涡旋振荡、瞬时离心后，分装至PCR 反应管中。向PCR 反应管中加入5μL核酸，标明位置后放入BIO-RAD CFX Connect荧光定量PCR仪，按试剂盒说明书编程运行。

2 结果

根据试剂盒说明书，磁珠法吸取200μL样品，加100μLElutionbuffer，最后获得100μLRNA 溶液；柱式法吸取100μL样品，加50μLElutionbuffer，最后获得50μLRNA 溶液。两种提取方法样品用量与获得核酸体积比例相当。以每种提取方法3 次平行提取病毒RNA 为模板，每次用同种荧光RT-PCR 试剂进行扩增。结果显示，磁珠法提取核酸的荧光RT-PCR 结果成功率较高，3 次检测，阳性率均为100%。结果见表1。

从每种提取方法的3 次平行荧光RT-PCR 检测中，各选取一张扩增效果较好的曲线图（见图1、图2），其中磁珠法提取核酸荧光RT-PCR 阳性样品的Ct 值范围为13.46～29.81（阳性对照Ct 值：19.70）；柱式法提取核酸荧光RT-PCR 阳性样品的Ct 值范围为17.09～31.23（阳性对照Ct 值：20.11）。

3 讨论

3.1 磁珠法提取核酸的检测灵敏度较高

表1 两种提取方法检测新城疫荧光RT-PC R阳性率的比较

图1 磁珠法提取核酸荧光RT-PCR 扩增曲线

图2 柱式法提取核酸荧光RT-PCR 扩增曲线

根据表1，对于22 份新城疫阳性待检样品，磁珠法提取核酸的荧光RT-PCR 检测结果全部为阳性，检出率达100%，而柱式法提取核酸的荧光RT-PCR 检测结果较好的一次，检出率仅达86.36%（19/22）；由图1 和图2 可知，磁珠法提取核酸的荧光RT-PCR 扩增曲线较好，反映出所提取核酸的浓度及纯度较高。这表明磁珠法提取核酸的检测灵敏度较高。对于检测一些病毒含量较低的样品而言，选择磁珠法提取核酸，可以避免因核酸提取效率低导致荧光RT-PCR 结果假阴性的出现，能够减少新城疫疫情诊断的失误。

3.2 磁珠法提取核酸的检测重复性较好

由表1 可知，3 次平行检测，磁珠法提取核酸的荧光RT-PCR检出率均为100%，检测结果一致。这表明磁珠法提取核酸的检测重复性较好。究其原因，应该与磁珠法提取原理及用机器代替人工进行全自动操作有关。在提取过程中磁珠的大表面积与目标核酸特异性地识别和高效结合，使其具有优越的洗脱效率，可有效提高提取核酸的浓度及纯度。

3.3 加强磁珠法在新城疫病毒核酸提取中的应用

做好新城疫监测工作，可为新城疫疫情预警预报提供有效技术支撑，是现阶段降低新城疫流行的重要手段。通过本研究发现，磁珠法提取核酸在新城疫的荧光定量检测中优于柱式法。在当前普遍采用荧光RT-PCR 检测方法的背景下，选择提取效率较高的核酸提取方法，可有效保证检测结果的准确性，因此建议各兽医实验室加强磁珠法在新城疫病毒核酸提取中的应用。