双水相法制备花生衣高纯度黄酮及其抗氧化的研究

蒋新龙 蒋益花 何星谷

(浙江树人大学生物与环境工程学院，杭州 310015)

近年来天然抗氧化剂已成为食品领域研究热点之一[1]。黄酮类化合物是一大类天然产物，黄酮类化合物因其独特的结构而具有良好的抗氧化、抗肿瘤、抗病毒、抗过敏、抗衰老、抗心脑血管病、免疫调节等作用[2]。其中抗氧化作用是黄酮类化合物最重要的生物活性[3]，在食品工业和医药行业有广泛的应用[4,5]。

花生衣是花生加工的附属产物，其主要成分为原花青素、儿茶素、维生素K、白藜芦醇等生物活性物质[6]，还含有多种黄酮类成分，包括槲皮素、原花色素低聚物等功能成分[7]，但大多被丢弃或作为廉价饲料及燃料使用。针对天然抗氧化剂市场的需求及花生衣资源化综合利用问题，以花生衣为原料，用超声-微波协同双水相制备黄酮粗提物；采用多级双水相体系纯化黄酮粗提物得到高纯度黄酮；以VC作对照，比较所得黄酮粗提物和高纯度黄酮的抗氧化活性相对大小，为花生衣变废为宝综合利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料试剂

花生衣：50 ℃鼓风干燥，粉碎过40目筛，备用。芦丁 (批号100080-200707)、DPPH；所用其他试剂均为分析纯。

CW-2000型超声-微波协同萃取/反应仪，UV-1600型紫外可见光谱仪，GZX-91400MBE电热恒温鼓风干燥箱，AB204-N 型分析天平。

1.2 方法

1.2.1 总黄酮的测定

根据硝酸铝-亚硝酸钠比色法测定黄酮含量[8]，得芦丁质量浓度C(mg/mL)与吸光度A之间的关系式为：A=25.289C+0.037 2，相关系数r=0.997 3。

精密称取一定质量的原料置于提取容器中，加入由一定体积一定浓度乙醇溶液和一定质量的无机盐组成的双水相体系，在一定提取条件下提取一定时间，趁热抽滤得滤液。静置5 min，待其分层，收集上清液，得到黄酮提取液。精密吸取黄酮提取液，以相应的试剂空白溶液为空白对照，根据硝酸铝-亚硝酸钠比色法测定黄酮含量[8]。按回归方程计算样品液中黄酮得率Y。

式中：n为稀释倍数；m为原料质量/g；V为提取液总体积/mL；C为回归方程的计算值/mg/mL。

1.2.2 黄酮提取实验设计

双水相体系的确定：徐方祥等[9]用微波辅助乙醇-磷酸氢二钾双水相的方法对菠萝皮中黄酮进行提取。根据池汝安等[10]采用浊点法所绘制的各双水相体系相图和南二龙[11]所建立的相比数据库，本研究选取磷酸氢二钾作为分相盐、乙醇作为有机相组成乙醇-磷酸氢二钾双水相提取黄酮。

超声-微波协同双水相提取花生衣黄酮：依据1.2.1方法，在原料质量0.500 0 g、磷酸氢二钾用量7 g、乙醇体积分数50%、液料比100∶1、微波时间30 min、微波功率300 W的条件下，采用控制变量法进行单因素实验。分别设置磷酸氢二钾用量梯度6.0、7.0、8.0、9.0、10.0 g；乙醇体积分数梯度40%、50%、60%、70%、80%；液料比梯度40∶1、60∶1、80∶1、100∶1、100∶1；提取时间梯度为10、20、25、30、40 min；微波功率梯度为100、200、300、400、500、600 W，考量磷酸氢二钾用量、乙醇体积分数、液料比、提取时间和微波功率五因素对黄酮得率的影响。在单因素实验基础上，以磷酸氢二钾用量或乙醇浓度为固定值，选取其他四个因素为自变量，利用正交实验 L9(34)对提取条件进行优化。

1.2.3 黄酮纯化实验设计

利用多级双水相体系制备高纯度黄酮：用最佳工艺条件进行双水相提取，得上相1；将上相1用旋转蒸发仪浓缩(设定温度40 ℃)至无乙醇得到浓缩液1，冷冻干燥浓缩液1可得粗黄酮产品1；将浓缩液1加入一定量无水乙醇和磷酸氢二钾重新得到最佳提取条件时的双水相体系，以4 000 r/min离心20 min，得上相2，旋转蒸发仪浓缩上相2得到浓缩液2，冷冻干燥浓缩液2可得纯化黄酮产品Ⅱ。分别测定两次双水相上相和下相中黄酮含量，求出两次双水相体系的分配系数和两个黄酮产品的纯度。

1.2.4 黄酮抗氧化活性实验设计

将粗黄酮产品和纯化黄酮产品加无水乙醇配制成100 μg/mL的高浓度溶液，再用无水乙醇稀释成2、5、8、10、20、40、60、80 μg/mL的样品溶液。以VC做参比，以半数清除率IC50值为抗氧化活性评价指标，比较花生衣粗黄酮、花生衣纯化黄酮、VC抗氧化活性相对大小。

DPPH·法是目前用以评价天然抗氧化剂抗氧化活性的一种简便、快速、灵敏可行的方法[12]。具体根据本团队方法实验[13]，计算DPPH·的清除率，并与VC的清除DPPH·能力进行比较。

1.3 统计方法及分析软件

指标均重复测定3次并取平均值，利用Origin 8软件作图；应用SPSS20.0软件进行数据统计，并用Duncan多重比较(SSR法)检验各处理平均数之间的差异显著性(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 黄酮提取实验

2.1.1 单因子实验

单因子提取实验结果如图1所示。

图1 单因子提取实验结果

磷酸氢二钾用量的影响：在乙醇-磷酸氢二钾双水相中，上相由混有少量水的乙醇构成，醇溶性黄酮提取后进入上相，下相由溶有磷酸氢二钾的水及少量乙醇构成。双水相的形成是乙醇与磷酸氢二钾争夺水分子的过程。盐的用量改变可影响上相的极性，随着盐用量的增加，盐对水的束缚能力增强，使上相中乙醇的相对体积分数增加[14]，最终影响到黄酮的得率。磷酸氢二钾用量为7.0 g时，黄酮的得率达到最高值。后续实验中固定磷酸氢二钾用量为7.0 g/50 mL，通过优化调节乙醇体积分数获得高选择性双水相体系。

乙醇体积分数对黄酮得率的影响：乙醇体积分数50%时黄酮得率达到最高值。乙醇体积分数直接影响双水相萃取效果，乙醇量太多会导致盐的析出，太少则无法形成双水相。因此，初步确定乙醇最佳体积分数为50%。

液料比对黄酮得率的影响：液料比在30～110 ∶1范围内，黄酮得率随着液料比的增加而提高，液料比为100 ∶1时，黄酮得率已达到接近最高值，再增大液料比黄酮得率提高不多。因此，初步选取最佳液料比为100 ∶1。

提取时间对黄酮得率的影响：在30 min时间内，黄酮得率随提取时间增加而提高，但超过30 min，黄酮得率不增反降，这主要由于黄酮中的酚羟基容易被氧化，故初步选取最佳提取时间为30 min。

微波功率对黄酮得率的影响：微波功率过高，体系升温过快，容易加速黄酮的氧化与降解。随着微波功率的增加，黄酮得率先增加后减少，在300 W时达到最大值。故初步选取最佳微波功率为300 W。

2.1.2 正交实验及结果分析

因为磷酸氢二钾用量7 g/50 mL与其他水平差异显著，所以正交实验时以磷酸氢二钾用量为固定值，通过优化调节乙醇体积分数获高选择性双水相体系。正交实验选取乙醇浓度、液料比、微波时间和微波功率四个因素为自变量，以黄酮得率为评价指标，利用正交实验 L9(34)对提取条件进行优化，四因子三水平正交实验的因子与水平见表1，正交实验结果及分析见表2，方差分析表见表3。

由表2的直观分析可知，水平组合A3B2C1D3最佳，得率为22.92%。由表2的极差分析，黄酮提取是A3B2C1D1最佳。由表3的方差分析可知，对黄酮得率的影响乙醇浓度(B)极显著，液料比(A)显著，提取时间(C)和微波功率(D)则不显著；对花生衣提取的影响影响依次为：B>A>C>D，与极差分析结果完全一致。Duncan多重比较分析，花生衣提取中微波功率(D)三水平之间无显著差异。综合分析提取成本和得率，确定花生衣黄酮的最佳工艺条件分别为A3B2C1D1。

表2 正交实验结果及分析

表3 方差分析表

根据最佳提取工艺条件进行验证实验，当磷酸氢二钾质量浓度7 g/50 mL(即140 mg/mL)、液料比100 ∶1、乙醇体积分数50%、提取时间20 min，微波功率为200 W时，花生衣得率为22.86%。实验结果与预测值无显著差异。

2.2 黄酮纯化实验结果与分析

实验结果表明，一级双水相体系提取后再进行二级双水相体系纯化，花生衣黄酮的分配系数由3.41增加到7.91，纯度由51.04%增加到80.17%。花生衣黄酮的分配系数和纯度分别提高2.3倍、1.6倍。白甫等[15]采用大孔吸附树脂纯化花生衣中总黄酮成分，总黄酮纯度达66.12%。所以利用多级双水相体系纯化制备高纯度花生衣黄酮是可行的。

2.3 黄酮抗氧化实验结果与分析

测定对DPPH·的清除率，并以相同质量浓度的VC作为阳性对照，黄酮清除DPPH·自由基的能力比较如图2所示。根据图2的量效关系构建浓度和清除率的线性方程，并求出清除率为50%时所需的浓度(IC50)，花生衣黄酮清除DPPH·自由基的能力见表4。表4表明，VC、花生衣粗黄酮、花生衣纯化黄酮在实验浓度范围内与清除DPPH·自由基呈现出良好的量效关系。VC、花生衣粗黄酮、花生衣纯化黄酮的IC50分别为11.11、47.59、46.59 μg/mL。纯化黄酮的抗氧化活性稍强于粗黄酮，跟其他学者的研究结果一致[16-18]。但花生衣黄酮的抗氧化活性弱于VC(P<0.05)。

图2 黄酮清除DPPH·自由基的能力比较

表4 花生衣黄酮清除DPPH·自由基的能力

3 结论

实验通过超声-微波协同双水相提取花生衣黄酮，最佳提取条件：乙醇体积分数50%、磷酸氢二钾质量浓度140 mg/mL、液料比100∶1、微波功率为200 W、提取时间20 min，得率为22.86%；二级双水相纯化，纯度可达80.17%。二级双水相纯化有利增强抗氧化活性，但花生衣黄酮的抗氧化活性弱于VC。超声-微波协同双水相法制备花生衣黄酮，纯度高，安全便捷，本研究为花生衣的进一步资源化开发利用提供了参考。