广西德保县黑猪主要疫病病原学和血清学检测

2021-04-07陆春礼黄百花黄宝学蒙振亩农爱红刘宏梅李雪珍谭光明

中国动物检疫 2021年4期

陆春礼，黄百花，黄宝学，蒙振亩，农爱红，刘宏梅，李雪珍，谭光明

（1.百色市动物疫病预防控制中心，广西百色 533000；2.田东县动物疫病预防控制中心，广西田东 531500；3.德保县动物疫病预防控制中心，广西德保 533700）

德保猪，也称德保黑猪，因体格健壮、适应性好、耐粗饲料、抗病力强、繁殖力高、胴体品质好、肉色鲜红、味美清香，而享誉区内外。1985 年，德保黑猪入选广西家畜家禽品种志，与陆川猪、隆林猪、桂中花猪、环江香猪、巴马香猪、全州东山猪等并列成为广西七大地方猪种，2009 年列入广西壮族自治区畜禽遗传资源保护名录。2014 年以来，为给德保黑猪产业化发展提供纯正的种源，德保县编制颁布了广西地方标准《德保猪》，指导养殖场（户）按照标准做好德保黑猪的保种繁育技术推广应用工作。2017 年以来，德保黑猪饲养量一直保持快速上升趋势，其中2017 年7 068 个场户饲养5.053 5 万头，2018 年7 089 个场户饲养5.208 3 万头，2019 年7 138 个场户饲养6.012 5 万头，2020 年7 215 个场户饲养8.061 6 万头。为推动德保黑猪产业化发展，德保县加大猪主要疫病的免疫与防控力度。为了解德保黑猪主要疫病的防控和免疫效果，2018—2020 年釆集166 个场点的病死德保黑猪样品进行非洲猪瘟（ASF）、猪瘟（CSF）、口蹄疫（FMD）、猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）、猪伪狂犬病（PR）、猪圆环病毒病（PCV-2）、猪支原体病（PPLO）、猪传染性胸膜肺炎（PCP）、猪链球菌病（SS）、猪流行性腹泻（PED）、猪传染性胃肠炎（TGE）等11 种疫病的病原学PCR 检测，2017—2020 年采集临床健康德保黑猪血清样品进行FMD、CSF、PRRS 等疫病的ELISA 免疫抗体检测，以期为德保黑猪针对性综合防控措施的制定提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品 2018—2020 年，在12 个乡镇随机采集166 个德保黑猪场点（包括规模场、散养户）病死猪的淋巴结、扁桃体和肺脏样品以及疑似PED 和TGE 猪的病变小肠组织和粪便样品，共计300 份，其中2018 年46 个场点100 份，2019年54 个场点100 份，2020 年66 个场点100 份，每个乡镇每年3～6 个场点，每个场点1～2 份样品。2017—2019 年，在每年春秋两防集中免疫1 个半月后，在德保县12 个乡镇，每个乡镇10 个场点，1 个场点每次采集2 份经CSF、FMD 和PRRS 免疫的德保黑猪血清样品行抗体检测，每年240 份，共采集720 份；2020 年随机选择5 个乡镇，每个乡镇10 个场点，每个场点2 份，共采集120 份血清。

1.1.2 试剂 20T、40T、64T 动物疫病病毒RNA/DNA 提取试剂盒，西安天隆科技有限公司生产；M-MLV 反转录酶、Rnasin、DL 2 000 DNA Marker，天根生物科技有限公司生产；50T Prime ScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2 试剂盒，TaKaRa公司生产；pH7.4 的PBS 缓冲液、0.5 g/mL 溴化乙锭、6×Loading Buffer、50×TAE，北京世纪元亨防疫技术有限公司生产；琼脂糖，BIOWEST 公司生产；非洲猪瘟荧光PCR 检测试剂盒，青岛立见公司生产；口蹄疫O 型液相阻断ELISA 试剂盒，兰州兽医研究所生产；猪繁殖与呼吸综合征病毒ELISA抗体检测试剂盒，西班牙海博莱公司生产；猪瘟抗体竞争ELISA 检测试剂盒，西班牙海博莱公司生产。

1.1.3 仪器 TissueLyser II 型组织研磨仪，德国QIAGEN 公司生产；NP968-C 型全自动核酸提取仪，西安天隆科技有限公司生产；BSC-1000-II-A2 型二级生物安全柜，苏州瑞威净化科技有限公司生产；单道、多道移液器（10、100、200、1 000 µL），艾本德（上海）国际贸易有限公司生产；LightCycler 96 型实时荧光定量PCR 仪，罗氏诊断产品（上海）有限公司生产；Biometra MyCycler 型PCR 仪，美国BIO-RAD 公司生产；BioDoc-IT2 凝胶成像系统，美国UVP 公司生产；DF-C11 型电泳仪、北京东方特力科贸中心公司生产；LabServ K3 型酶标仪，赛默飞世尔（上海）仪器有限公司；Wellwash 型自动洗板机，赛默飞世尔科技（中国）有限公司等。

1.2 方法

1.2.1 DNA 和RNA 模板制备取10 g 病料组织，用手术剪剪碎，放于灭菌干燥的2 mL EP 管中，加入1 mL 生理盐水及3 颗经灭菌的钢珠后，放到组织研磨仪捣碎，12 000 r/min 离心2 min，抽取上清200 µL 放入自动核酸提取盒中并加入20 µL 蛋白酶K，自动抽提30 min。将抽提到的核酸，一部分用于cDNA 合成，一部分作为DNA 模板直接用于DNA 病毒扩增。

1.2.2 PCR、RT-PCR 及荧光PCR FMD、CSF、PRRS、PR、PCV-2、PPLO、SS、PED、TGE 检测分别采用国家标准GB/T 27528—2011、GB/T 27540—2011、GB/T 35912—2018、GB/T 35911—2018、GB/T 35901—2018、GB/T 35909—2018、GB/T 19915.7—2005、GB/T 36871—2018；PCP 检测采用地方标准DB51/T 2310—2016；ASF 检测采用世界动物卫生组织标准TaqMan PCR 程序。按照上述标准方法配置PCR、RT-PCR 及荧光PCR 体系，并按相应的说明书进行模板扩增。

1.2.3 扩增产物分析 PCR、RT-PCR，取10 µL扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳后，在凝胶成像仪上观察结果；使用DL 2 000 DNA Marker 作为分子标记，扩增出与相应标准一样大小的目的片段，判为病原核酸阳性。荧光PCR，按照扩增试剂盒说明书进行扩增，得出与说明书上一致的S 曲线，且Ct ≤35，判为病原核酸阳性。

1.2.4 抗体检测按照各类疫病相应的抗体检测试剂盒说明书进行操作，并在酶标仪上读数和判定。

2 结果与分析

2.1 病原学检测

病原学检测结果（表1）显示：病死德保黑猪PCV-2 样品阳性检出率最高，为68.3%，场点阳性检出率为81.3%；PRRS、PR、PED、PPLO、SS 等疫病病原的样品阳性检出率较低，分别为1.7%、1.0%、1.0%、0.3%、0.3%，场点阳性检出率分别为3.0%、1.8%、1.8%、0.6%、0.6%；ASF、CSF、FMD、PCP、TGE 等疫病病原均未检出阳性。病原阳性样品中，有4 份样品同时检出2 种病原阳性，占检测样品总数的1.3%，分别为“PCV-2+SS”阳性1 份、“PCV-2+PPLO”阳性1份、“PCV-2+PR”阳性2 份。

表1 2018—2020 年德保黑猪主要疫病病原学检测结果统计 %

2.2 血清抗体检测

血清抗体检测结果（表2）显示：2017—2020年，CSF 抗体阳性率最高，平均为95.8%；FMD、PRRS 抗体阳性率偏低，分别为79.3%、73.2%，且抗体阳性率不稳定，变化起伏较大，部分年份低于规定要求（不低于70%）。

表2 2017—2020 年德保黑猪3 种疫病的血清抗体检测结果统计

3 讨论

3.1 德保黑猪疫病防控效果总体较好

近年来，在国家强制免疫政策和各地高度重视落实各项防控措施的大背景下，德保黑猪主要疫病防控水平稳步提高，猪群疫情整体平稳。本次检测未在病死猪中检出ASF、CSF、FMD、PCP、TGE 等5 种疫病病原，且PRRS、PR、PED、PPLO、SS 等疫病的病原阳性检出率也较低，均在1.7%以下，说明这些疫病在德保黑猪群中不断得到控制和净化，表明地方政府采取的防控措施取得了明显效果。这为今后德保县开展星级无规定疫病净化工作奠定了基础。

3.2 PCV-2 感染较为严重

从病原学检测结果可以看出，PCV2 在德保黑猪群中流行较为普遍，是德保黑猪发病死亡的主要病因之一。2000 年有学者首次报道国内猪群存在PCV-2 感染[1]，随后发现国内PCV-2 感染相当普遍[2]；李金凤等[3]2017 年对来自广西不同地区的80 份猪肺脏样品进行PCV-2 核酸检测，结果发现感染率为43.8%；李晓红等[4]2013—2016 年对采自云南省芒市11 个乡镇未接种PCV-2 疫苗的猪血清1 472 份进行病原检测，结果检出率为44.6%；刘浩等[5]2013 年9 月—2014 年6 月对陕西省汉中市15 个规模场生猪进行PCV-2 检测，发现样品阳性率为75.6%，场群阳性率为100%。在饲养条件差及管理欠佳的猪场，PCV-2 更容易传播和扩散[6-7]。德保黑猪饲养环境相对较差、管理落后，这也是德保黑猪极易感染PCV-2 的主要原因。为了减少PCV-2 引起的危害，建议规模猪场根据实际情况使用PCV-2灭活疫苗进行免疫，并主动开展跟踪监测，对病原学检测结果呈阳性的，立即采取隔离或淘汰措施，逐步降低自然感染率；同时加强饲养管理，控制良好的饲养环境，以降低患病风险。

3.3 多种病原混合感染依然存在

病原学检测发现，有4 份样品同时检出2 种病原，主要是PCV-2 与其他病原混合感染。施开创等[8]检测了694 份采自广西地区的猪组织样品，发现2 种病原混合感染率为35.1%，3 种病原混合感染率为4.0%；崔新格等[9]对2017—2018 年河南省255 份病料进行检测，发现PED 分别与猪冠状病毒（PDCoV）、TGE 的混合感染率为14.1%、2.4%，3 种病原混合感染率为2.0%。上述研究表明，猪群中的多病原混合感染较为普遍，这也是引起猪群发病和死亡的重要原因。有研究[10]发现，PCV-2 多为隐性感染，很少表现临床病症。本次检测的样品均来自病死猪群，PCV-2 检出率较高，暗示导致猪群发病死亡的还有其他病原的混合感染。为防止生猪发生混合感染，应制定科学合理的综合防控措施。

3.4 部分疫病免疫质量不稳定

本次血清抗体检测发现，CSF 免疫效果较好，免疫抗体阳性率平均为95.8%，但FMD、PRRS 免疫效果不理想，不同年份的抗体阳性率变化起伏较大，部分年份低于规定要求（70%）。谭光明等[11]研究德保县生猪FMD、CSF、PRRS 3 种疫苗不同免疫程序的应用效果，认为疫苗免疫效果不均衡主要原因有几方面：一是有不同乡镇采用的免疫程序不一样；二是德保县部分动物防疫员习惯将免疫与阉割同时进行，从而导致机体疫苗应答效果不佳；三是存在一些免疫抑制病。司兴奎等[12-13]研究发现，PCV2 感染确实可以影响FMD、PRRS 疫苗的免疫效果。因此，推测PCV-2 感染可能是德保黑猪FMD、PRRS抗体阳性率较低且不平衡主要原因。