山东省菏泽市某规模猪场不同猪群伪狂犬病野毒感染情况调查

贾义平，李翠玲，樊祜卿，王 曼

（1.菏泽市动物疫病预防控制中心，山东菏泽 274000；2.成武县畜牧服务中心，山东成武 274200）

伪狂犬病（pseudorabies，PR）是由伪狂犬病毒（pseudorabies virus，PRV）引起的，以家畜和多种野生动物发热、奇痒及脑脊髓炎为特征的急性、热性传染病，呈世界性分布。猪是PRV 的天然宿主，因此PRV 对养猪业危害最为严重[1]。感染PRV 后，妊娠母猪可出现产木乃伊胎或死胎等流产症状[2]；不到7 日龄的仔猪，以无明显临床症状的突然死亡为特征；2～3 周龄仔猪可出现严重的中枢神经症状，死亡率可高达100%；保育猪可出现神经症状和呼吸道症状，致死率为10%～20%；生长猪和育肥猪可出现呼吸道症状，常因继发细菌性肺炎而死亡[3]。2011 年以后，PR 在我国从北向南又出现了新一轮流行，到2017 年全国各地仍时有PR 暴发和流行，造成了严重经济损失[4-5]。本研究检测分析了山东省菏泽市某规模化PRV 阳性猪场不同猪群感染情况，以及不同生产阶段和场区环境中的病毒分布情况，以期为规模化猪场的PR 免疫及生物安全防控提供依据。

1 材料与方法

1.1 猪场发病概况

该猪场存栏母猪约1 000 头。2019 年9 月育肥猪首先出现呼吸困难、体质量下降、咳嗽等症状，死淘率近8%；随即保育猪出现咳嗽、四肢划水、被毛粗乱、精神萎靡等临床特征，死淘率约10%。之后逐渐波及产房，新生仔猪无明显临床症状死亡，2～3 周龄仔猪出现战栗、惊厥、震颤、四肢划水等神经症状，病死率达15%，同时妊娠舍怀孕母猪出现流产（产木乃伊胎、死胎）以及呼吸道症状和高烧等特征，流产率约10%。该场PR 疫苗免疫程序见表1。

表1 该猪场PR 疫苗免疫程序

为查明原因，在猪场发病后立即采集20 份病料（育肥猪4 份、仔猪8 份、流产胎儿8 份），采用荧光定量PCR 方法，进行猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、PRV、猪圆环病毒2 型（PCV2）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）检测。根据检测结果，结合临床症状，判断PRV是引起猪场发病的主要原因。随后对PRV-gE基因进行测序。遗传进化分析显示，该规模化猪场中流行的PRV 属于2.3 型变异野毒株。

1.2 样品采集

为进一步调查PRV 在该规模化猪场各猪群中的感染情况、场区环境分布情况及病毒载量，随机采集猪场临床健康猪只鼻拭子（因鼻腔的PRV 滴度效价较高[6]），包括：母猪鼻拭子129 份，其中断奶后20 份、妊娠前期（＜30 d）22 份、妊娠中期（31～85 d）25 份、妊娠后期（86～114 d）30 份、哺乳期32 份；仔猪（15～21 日龄）鼻拭子50 份，保育猪（45～50 日龄）鼻拭子25 份；育肥猪鼻拭子90份，其中80～90日龄32份、120～130日龄30份、160～180 日龄28 份；场区环境样本拭子，包含圈舍、饲料、水源、粪便等各5 份。将采集的新鲜拭子样本，使用灭菌生理盐水悬浮。样本收集后，若不能即时检测，则2～8 ℃冷藏过夜保存；若长期保存，则-80 ℃冷冻保存。

1.3 检测及分析

采用PRV-gE基因荧光定量PCR 检测试剂盒（武汉科前生物股份有限公司产品），按照试剂盒使用说明进行检测。结果判定：Ct ≤35 或有明显指数增长期，为阳性；Ct 值在35～38 范围内，则对标本进行重复检测，若Ct 值仍在35～38 范围内，且有明显指数增长期，为阳性，反之为阴性；Ct ＞38 或无Ct 值，为阴性。将标准品Ct 值与浓度制作成标准曲线，然后依据待检样品Ct 值计算待检样品浓度，并换算成拷贝数。采用Excel 软件对试验数据进行处理，使用SPSS 19.0 软件，对检测结果进行加权处理后实施卡方检验，显著水平为P＜0.05。

2 结果与分析

2.1 母猪群检测

检测结果（表2）显示：母猪群PRV-gE平均阳性率为17.83%，妊娠前后各阶段表现为先上升后下降趋势，其中妊娠中期最高，为24.00%。经SPSS 卡方检验，各阶段阳性率差异不明显（P＞0.05）。

2.2 生长猪群检测

检测结果（表3）显示：生长猪群PRV-gE平均阳性率为11.52%，且随日龄增长呈现急速上升又快速下降趋势，其中80～90 日龄育肥猪阳性率最高，为28.13%，经SPSS 卡方检验，与其他日龄段猪群差异显著（P＜0.05）。

表2 母猪群PRV-gE 核酸荧光PCR 检测结果

表3 生长猪群PRV-gE 核酸荧光PCR 检测结果

2.3 不同生产阶段场区环境及猪群病毒载量检测

检测结果（表4）显示：饲料、水源、上猪台和出猪台样品中未检测到PRV-gE阳性，而妊娠舍（粪沟、限位栏表面、妊娠母猪），产房（粪沟、产床表面、分娩舍底部、哺乳母猪、仔猪），保育和育肥舍（圈舍栏表面、保育猪、育肥猪）样品中均检测到PRV-gE阳性；育肥猪群带毒量最高，为3.6×105拷贝数/mL，经SPSS 卡方检验，与其他环境及猪群样品差异均显著（P＜0.05）。

3 讨论

PR 流行给国内养猪业带来了巨大经济损失[7]。2012 年以后，我国各地Bartha-K61 疫苗免疫猪群也发生过大规模PR 疫情或处于野毒感染状态，导致种猪繁殖障碍，仔猪死亡率升高。Gu 等[8]对山东省2013—2016 年采集的2 033 份血清抗体进行检测，发现PR 野毒抗体阳性率为57.8%；张晓阳[9]对山东省2018 年采集的5 038 份血清抗体进行检测，发现gE 抗体总体阳性率为45.00%。上述结果表明，PRV 变异毒株已经在山东省广泛流行，并持续感染。另有研究[10]表明，Bartha-K61 疫苗对分离到的PR 毒株仅能提供50%的交叉保护。Zhou 等[11]在山东省某猪场的研究结果表明，免疫Bartha-K61 毒株疫苗后，仍然出现仔猪顽固性腹泻、神经症状以及母猪流产、产死胎等症状。该猪场免疫疫苗同样为Bartha-K61，仍然发生PR 野毒感染，表明Bartha-K61 疫苗不能完全抵御野毒入侵。

表4 不同生产阶段场区环境和猪群病毒载量检测结果

杨涛等[12]在分子生物学水平上比较了PRV Bartha-K61 疫苗株与当前流行的变异株之间的差异，发现疫苗株和变异株分属于不同的分支。古金元等[13]和刘照虎等[14]分别对山东省不同地区的规模猪场进行了PRV 分离，发现分离株与国内报道的PRV 变异株核苷酸同源性均高于欧美毒株，与疫苗株Bartha-K61 株遗传距离较远。这进一步解释了该猪场免疫的Bartha-K61 疫苗株不能对变异株提供充足保护的原因。

PR 发生后，为探究该猪场不同猪群感染情况，以便为后期疫苗免疫程序优化和生物安全防控提供数据支撑，本研究检测了不同猪群的鼻拭子样品，发现病原总体阳性率为14.28%。张树金等[15]在2015—2017 年对山东省PRV 流行情况进行调查，发现PRV 平均抗原阳性率为12.30%。刘照虎等[14]在山东省进行PR 检测分析，发现2017 年、2018年的病原阳性率分别为11.20%、7.54%。该猪场检出的PR 病原阳性率较高，说明本场PRV 感染较为严重，当然也可能与本次检测样本量较小有关，后需进一步扩大检测样本量。对生长猪群进行PRV 检测时发现，不同生长猪群间的病原阳性率有差异，其中育肥猪显著高于其他日龄段。这一方面和该场使用的Bartha-K61 疫苗株与变异株同源性较差，交叉保护力不足有关；另一方面可能是二免日龄过早（35 日龄），受母源抗体干扰，导致75 日龄二次加强免疫效果较差，产生保护力不足。在对妊娠母猪群进行PRV 检测发现，妊娠母猪群间的病原阳性率差异不明显，但妊娠中期略高。张嘉保等[16]在对妊娠母猪细胞免疫水平的研究中发现，妊娠中期免疫抑制作用较强（差异不显著）。另有研究[17]表明，妊娠可以使病毒活化，增加感染PRV 的潜在风险，且孕期的胎盘传播，主要从怀孕中期开始。本研究发现，母猪妊娠中期病原阳性率较高，这可能与母猪妊娠中期的免疫抑制有关。

鼻腔黏膜和口腔是PRV 感染的主要入侵部位[18]。研究[19]表明，感染PRV 猪的分泌物、排泄物和呼吸物中都有较高的病毒载量，且病毒对外界环境具有较强的抵抗力。本研究发现，除饲料、水源、上猪台、售猪台外，不同猪群及各阶段生产环境中均可检测到PRV，且猪群带毒量越高，相应环境中的病毒载量就越高。这进一步说明该猪场PRV 的传播主要通过猪与猪的直接接触，或是与PRV 污染的感染物相接触。故严格执行场区各生产阶段的有效隔离，加强消毒处理，对于防止PRV 传播尤为重要。

综上，该规模猪场不同猪群均遭受PRV 不同程度的感染，尤其是母猪妊娠中期和育肥猪早期，且大部分环境中均能检测到病毒。因此，规模猪场要加强PRV 监测，通过监测来调整优化PR 免疫程序，同时要加强生物安全控制，进行系统性防控。