NLRP1信号通路在心房颤动发病机制中的作用

康品方，朱飞宇,2a，高琦,2a，高琴，唐碧，王洪巨

心房颤动(atrial fibrillation, AF)发病以各种内外源性因素干扰正常心房电生理为诱发因素，引起局灶性异位活动和折返，从而引起心房的高频兴奋，导致心房的不同步收缩和心室的不规则兴奋，最终引起心脏损伤及心脏负荷加重[1-2]。炎症与AF发存在密切关联性，如AF患者血清炎症标志物水平升高[1]。AF发病常始于阵发性发作并随着频率和持续时间增加演变为持久型房颤，即“房颤诱发房颤”现象，炎症反应可通过介导心房电重构和结构重构，从而与房颤的发生和进展相互促进[2-6]，而房颤本身可在心房重塑过程中诱发炎症，使心律失常持续存在[3]，表明炎症与房颤相关。IL-1β是炎症反应的关键介质，对于宿主反应和抵抗病原体必不可少，但在慢性病和急性组织损伤时加剧损害[4]。针对白细胞介素IL-1β的抗炎治疗降低了既往心脏病发作患者复发心血管事件的风险[5]。炎症小体是细胞内的蛋白复合物，在引起细胞程序性死亡的同时具有炎症活化作用。NLRP1炎症小体参与多种疾病，特别是心血管疾病[6]。NLRP1可在内外源性损伤因素作用下聚集ASC，诱导Caspase-1蛋白前体活化，促进IL-1β产生。房颤患者外周血NLRP 1-ASC-Caspase-1通路可能在某种诱因下被激活，释放具有活性的 IL-1β，进而激活下游信号通路，促发心脏局部或全身的炎症反应，诱发房颤的发病与进展。

孤立性房颤患者心房病理呈淋巴单核细胞浸润和邻近肌细胞坏死[7]。另外，PAF或nPAF患者外周血中活化的T淋巴细胞(CD3)百分比较高，对于复律后维持窦性心律患者，活化现象可逆转[8]。淋巴单核细胞在心房中分泌高水平的转化生长因子(TGF)-β1、TNF、和IL-6，导致心房纤维化和电重构[9-10]。提示PBMC可能通过炎症活化参与心房颤动的发病，但目前房颤患者PBMCs中炎症活化的机制及致病过程尚未被阐明，缺乏临床相关性研究。本研究拟通过观察PA患者PBMCs中NLRP1炎症小体相关信号通路蛋白表达水平，探讨PBMCs中NLRP1诱导的炎症信号通路在AF发病机制中的作用。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选择2019年1月—2019年12月我院收治的房颤患者(AF)40例，其中阵发性房颤(PAF)和非阵发性房颤(nPAF)各20例，所有受试者均行12导联心电图或24小时动态心电图检查。选取同期体检者20例作为正常对照组(CON组)，入选患者均签署知情同意书，研究方案获得本院伦理委员会批准(2019KY023)。诊断标准：PAF定义为房颤7天内终止，否则定义为nPAF[11]；排除标准：严重心血管疾病、高血糖、肝肾疾病、骨折、肺部疾病、感染性和自身免疫性疾病、肿瘤、精神疾病患者。

1.2 试剂材料 NLRP1抗体：Abcam公司；ASC、Caspase-1抗体：Novus Biologicals公司；β-actin抗体来自protintech公司；免疫磁珠试剂盒：STEMCELL Technologies公司；人外周血淋巴细胞分离液：北京索莱宝科技有限公司；Trizol试剂、荧光定量检测试剂盒、第一链合成试剂盒：TIANGEN公司；引物：上海生工生物工程有限公司(序列：表1)。

1.3 方法

1.3.1 样本准备与PBMCs分离 标本准备：所有患者通宵禁食,早上采集外周血置于EDTA-抗凝管中，离心，取上层血浆，于-80 ℃冰箱保存。

PBMCs分离：患者外周血液用磷酸盐缓冲盐水(PBS)稀释两倍，加至淋巴细胞分离液层面上，2 000 r/min离心20 min，用巴式管轻轻吸出此PBMC层的细胞,用PBS重悬细胞，4 ℃、1 500 r/min离心10 min，弃上清，重复2次，用移液枪吸出残留液体，加入配置好的血清(胎牛血清：二甲基亚砜=9∶1)重悬细胞，转移至冻存管。-80 ℃冰箱保存。

表1 引物序列

1.3.2 qRT-PCR检测NLRP1通路相关mRNA在PBMCs中的表达水平 用Trizol试剂提取PBMC总RNA。用反转录试剂盒合成cDNA。采用SYBR实时荧光定量PCR方法进行荧光定量。用β-actin进行校正，用2-ΔΔt法进行相对数据处理，计算相关基因的表达率。

1.3.3 Western blot检测NLRP1通路相关蛋白在PBMCs中的表达情况 使用前期提取的PBMCs，使用RIPA缓冲液加蛋白酶抑制剂提取总蛋白，10 % SDS-PAGE电泳，PVDF膜转膜；脱脂牛奶常温封闭2 h；一抗室温孵育4 ℃过夜二抗室温孵育1 h；ECL发光试剂盒发光，凝胶成像系统获取图像。

1.3.4 ELISA法检测各组血浆中IL-1β 水平 使用ELISA法测定血浆中IL-1β水平，根据生产商说明检测吸光度值，根据标准曲线计算相应血浆样品中IL-1β的含量。

2 结果

2.1 3组受试者临床资料比较 3组受试者年龄、性别、血糖水平、ALT、TG、HDL、Scr、LDL、AST指标比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

2.2 流式细胞术鉴定人PBMCs纯度 用磁珠结合CD14+抗体纯化受试者PBMC后，经流式细胞仪分选鉴定显示，PBMCs纯度在90%以上。见图1。

表2 3组受试者临床资料比较 (n=20)

1A 同型对照组 1B 试验组FITC-CD14 1C 同型对照组+试验组图1 人CD14+抗体纯化后的PBMC纯度

2.3 3组受试者PBMCs中NLRP1通路的mRNA表达水平比较 以对照组mRNA水平行归一化处理，结果示：PAF组NLRP1(2.134±0.107)、ASC(1.947±0.217)、Caspase-1(2.054±0.193)的mRNA表达水平高于CON组(1.000,1.000,1.000),低于nPAF组(8.248±1.404, 3.718±0.5254, 6.036±0.475)，差异有统计学意义(P<0.01)。见图2。

2A 3组受试者NLRP1 mRNA表达水平 2B 3组受试者ASC mRNA表达水平 2C 3组受试者Caspase-1 mRNA表达水平图2 3组受试者PBMCs中NLRP1(A), ASC(B), Caspase-1(C) mRNA表达水平。注：与CON组比较，*P<0.05； 与PAF组比较，#P<0.05。

2.4 3组受试者PBMCs中NLRP1信号通路蛋白表达水平比较 PAF组NLRP1(0.672±0.270), ASC(0.667±0.218),Caspase-1(0.725±0.185)蛋白表达水平高于CON组(0.304±0.140, 0.296±0.177, 0.426±0.141)，低于nPAF组(1.070±0.244, 1.112±0.215, 1.098±0.195)，差异有统计学意义(P<0.01)。见图3。

图3 3组受试者PBMCs中NLRP1, ASC, Caspase-1蛋白表达水平。 注：与CON组比较，*P<0.01 ;与PAF组比较，#P<0.01。

2.5 3组受试者PBMC中IL-1β水平比较 PAF组IL-1β水平高于CON组，低于nPAF组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 3组受试者PBMC中IL-1β水平比较

3 讨论

AF为临床常见心率失常，在心房重构过程中会自发诱发炎症反应，从而导致心律失常[12-13]，Bruins等[14]首次报道AF与炎症间可能存在关联性后，这种关联性不久便被进一步得到了验证[15]，这表明炎症过程是一个潜在的治疗靶点。使用皮质类固醇预防炎症也可以减少电复律后AF复发[16-18]，而动物模型进一步表明了AF和炎症之间的关联性，如犬无菌心包炎模型中，发生AF的几率显著增加[19-20]。

AF患体内能检测到炎症活化(如中性粒细胞及淋巴细胞的升高)及促炎因子(如IL-1β，IL-18和TNF-α等)释放[3-9]。此外，在房颤的预后评估中，炎症因子尚具有一定的预测价值[6，21]。一般认为，持续应用促炎细胞因子IL-1β，可通过环氧合酶和脂氧合酶途径产生的脂质第二信使改变心肌细胞的电学特性[22]；大鼠经IL-1β受体拮抗剂(IL-1Ra)治疗后，中性粒细胞蛋白酶导管素G注射分娩后表现出炎症减少和心脏重塑和功能的改善[23]。IL-1β基因表达的上调影响胶原蛋白代谢，可能有助于AF期间的心房纤维化[24]。表明IL-1β可能参与了AF的发病。本研究发现PAF组和nPAF组患者血清IL-1β水平高于对照组，nPAF组患者血清IL-1β水平高于PAF组，提示IL-1β可能参与了AF的发病。

关于炎症的活化具有多种途径，其中NLRP信号通路是近年来研究的热点。机体在内外源性损伤因素作用下可引起NLRP的表达并聚集ASC，激活Caspase-1，活化的Caspase-1促进IL-1β的表达与成熟[25]。NLRP信号通路的异常活化与类风湿性关节炎(RA)，克罗恩病，系统性红斑狼疮(SLE)，肾小球肾炎等多种慢性炎症疾病密切相关[26-29]。AF与在心脏组织和循环过程中介导炎症反应的免疫细胞和相关蛋白的浸润有关[30]，但其具体机制尚不明确。本研究检测患者PBMCs中NLRP1、ASC和Caspase-1信号通路的表达水平，发现PAF组和NPAF组患者外周血中NLRP1、ASC、Caspase-1 mRNA和蛋白表达均高于正常组，nPAF组高于PAF组；血清炎症产物IL-1β表达在3组间与其一致；提示AF的发病可能与NLRP1-ASC-Caspase-1信号通路诱导的炎症激活有关。

综上所述，AF患者PBMC中NLRP1-ASC-Caspase-1信号通路相关蛋白的表达随着炎症的激活而显著增加，且随AF类型的加重而增加。此外，目前还没有对PBMCs中的相关信号通路采取干预措施，以验证通路诱导的慢性炎症在心房颤动治疗中的作用。因此，欢迎更深入的动物实验进一步探索NLRP1通路在心房颤动中作用的具体机制。