小龙虾黑鳃上白流苏真菌的中国新记录属和新记录种

赵楠，杨鹤同，赵桂华，2

（1.江苏农林职业技术学院，江苏 句容 212400；2.句容市润泰生物科技有限公司，江苏 句容 212400）

白流苏属[AlbifimbriaL. Lombard & Crous（MB815924）]隶属于半知菌亚门、丝孢纲、葡萄穗霉菌科（Stachybotriaceae），该科于2014 年由Crous 等[1]建立，包括了白流苏属在内的24 属106 种[2]。

2016 年，Lombard & Crous[2]建立了白流苏属（A.L. Lombard & Crous, gen. nov.）新属，包括绿色白流苏菌（A.viridisL.Lombard&Crous，MB815928）、侧生白流苏菌（A.lateralisL.Lombard&Crous,MB815925）、土生白流苏菌（A. terrestrisL. Lombard & Crous，MB815926）3 个新种和瘤状白流苏菌[A. verrucaria（Alb. & Schwein.）L. Lombard & Crous, MB815927]一个新组合。有性世代不详。

在我国，小龙虾是绿色白流苏菌的新宿主；在实验室条件下，对该菌的培养性状、形态特征和DNA进行了研究。

1 材料与方法

1.1 材料来源

2018 年6 月13 日，在句容市润泰生物科技有限公司养殖基地（31°50′73″N，119°10′08″E）采集到患有小龙虾黑鳃病标本，装入标本袋，放在4 ℃低温冷藏箱保存备用。

1.2 分离培养

将病虾黑鳃放在自来水龙头冲洗1 h 后，再放在灭菌水中洗3 次，取出后用灭菌的滤纸吸干黑鳃上的水分，用灭菌的剪刀将病鳃片剪下，在无菌条件下，转移到含有PDA 培养基的培养皿内，每皿放5块鳃片组织，置于（25±2）℃的PRX-250A 型智能人工气候箱内培养（RH70%，黑暗），共分离12 皿60块，5 d 后取出检查，并统计分离结果。对不同颜色的真菌菌落分别进行纯化、编号。对分离到的细菌未作进一步研究。

1.3 形态观察

①将菌株接种到PDA 平面培养基上7～10 d（培养条件同1.2）观察菌落生长形状。

②载玻片培养：挑取该真菌的菌丝少许，接种到载玻片上的PDA 培养基上[3]（培养条件同1.2），培养5～6 d，待产生分生孢子后，做成临时玻片，在德国蔡斯（Zeiss Imagers.A1）光学显微镜下观察分生孢子梗和分生孢子的形态，测量大小（n=30），并拍照。再根据相关资料[2]进行形态学比对、鉴定。

1.4 DNA 提取、纯化和测序

该真菌的DNA 提取、PCR 扩增和测序反应的试验方法和步骤由南京金斯瑞生物科技有限公司协助完成，测序结果在GenBank 数据库中通过NCBI的Blast 检索系统进行序列同源性比对。测序菌株代号为177（保存菌种代号NLHf-6，即黑鳃病真菌6 号菌株）。

2 结果

2.1 分离结果

在60 块鳃片上共分离得到真菌菌落37 个，占61.7%，细菌菌落23 个，占38.3%；经初步鉴定，真菌有5 属7 种，其中包括绿色白流苏菌；其他的分离结果该文不作讨论。

2.2 白流苏属

AlbifimbriaL. Lombard & Crous,Persoonia36:177 (2016)

MycoBank MB815924

该属为中国新的记录属，模式种为瘤状白流苏菌[A.verrucaria（Alb.&Schwein.）L.Lombard&Crous.]，有性态未知。

在PDA 培养基上菌落白色，生长较慢。孢梗束似子座，表生，杯状到盘状，卵形到长形或外表不规则形状，周围有白色条纹，淡橄榄绿到暗绿色的菌丝丛；分生孢子堆粘头状；单根分生孢子梗从表面菌丝直接产生，桶状、肾形至腊肠形，无色，光滑；子座的圆胞组织发育良好，无色。刚毛单生，不分枝，具分隔，无色，表面粗糙，薄壁，直或弯曲，从分生孢子梗之间或白色条纹中的子座基部直接产生；分生孢子梗菌丝状，不规则，轮生或瓶梗状分枝，无色，光滑；产孢细胞瓶梗状，无色，光滑，圆柱形至腊肠形，具明显囊领；分生孢子无隔膜，椭圆形、纺锤形、柠檬形到近圆形，无色，光滑[2]。

2.3 绿色白流苏菌

为中国新记录的种（图1、图2）。

A. viridisL. Lombard & Crous,Persoonia36:178 (2016) Fig.1～Fig.2

MycoBank: MB815928

2.3.1 培养性状 在（25±2）℃（RH70%，黑暗）的PDA培养基上菌落生长慢，平均日生长量为2.5 mm，菌落白色（图1），具短的气生菌丝，在孢梗束上形成淡绿色分生孢子堆；培养皿背面为淡土黄色。菌落边缘具偶散生的孢梗束，后期淡土黄色分泌物会扩散到PDA 培养基中。

2.3.2 形态特征 该真菌的分生孢子座表生，杯状至盘状，单生聚生，卵形至长形或不规则形，（110～640）μm×（53～162）μm，菌落边缘有刚毛，刚毛生于子座基部薄壁细胞，无色，具小瘤，有分隔，不分枝，弯曲到旋转状，顶端钝圆，（58～90）μm×（3～4.2）μm；分生孢子梗从子座基部产生，分枝，无色，光滑，长达65 μm（图2a）；产孢细胞瓶梗状，圆柱形，无色，光滑，（8～14）μm ×（1～2）μm，具明显的囊领；分生孢子单细胞，光滑，无色，纺锤形，梭形，（7.5～8）μm×（2～3）μm（图2b）。

该真菌分布在印度西部的浦那（Poona）市、伊拉克、美国堪萨斯州等地，中国属于首次记载。小龙虾是该真菌的新宿主。

图1 绿色白流苏菌在PDA 上的菌落

图2 绿色白流苏菌分生孢子梗和分生孢子

2.4 分子鉴定

通过对该真菌菌丝的DNA 提取，用ITS1 和ITS4 的通用引物进行PCR 扩增，得到长度为567 bp 的特异性DNA 片段。扩增ITS 区全序列（图3），结果为：

对扩增片段进行测序，用NCBI 的Blast 在Genbank 中搜寻相似序列，结果与Genbank 中登陆号为KU845899.1,KU845897.1,KU845896.1 和KU845892.1[包括18S 核糖体RNA 基因的部分序列，ITS1（内转录间隔区1），5.8S 核糖体RNA 基因和ITS2 全序列，内转录间隔区2 全序列和28 S 核糖体RNA 基因部分序列]的同源性均为100%，因此，可以确定小龙虾黑鳃上的菌株为绿色白流苏菌（A. viridis），菌株保存在江苏农林职业技术学院生物工程技术中心真菌研究室，菌株编号为NLHf-6。

图3 ITS 1 和ITS 4 区域的PCR 扩增产物电泳图

2.5 相似种的比较

根据2016 年Lombard 等[2]报道的白流苏属的4个种，土生白流苏菌（A. terrestris）作为一个新组合，与其他2 个种形成了高度支持的进化枝，形态学类似于瘤状白流苏菌（A. verrucaria）[4]和绿色白流苏菌。土生白流苏菌的分生孢子（6～8）μm×（2～3）μm，平均（7×3）μm，比瘤状白流苏菌和绿色白流苏[（7～8）μm ×（2～3）μm]略小一些[4]，而侧生白流苏菌（A.lateralis）的分生孢子（4～6）μm×（2～4）μm，平均（5×3）μm，是分生孢子最小的种[2]。

绿色白流苏是小龙虾黑鳃病鳃组织上的一种真菌，是否是病原仍需进行致病性试验才能确定。