MPB64免疫胶体金法在新发肺结核患者中的应用

戴小丽 许燕燕 刘涛 侯彦强

1上海市松江区中心医院检验科 201600；2上海市松江区中心医院病理科 201600通信作者：许燕燕，Email：274371867@qq.com

肺结核病目前仍然是严重危害人类健康的全球性公共卫生问题，尤其新发肺结核患者的诊断和治疗方案很大程度上依赖于结核分支杆菌的实验室检查。疑似新发肺结核病患者初次痰菌抗酸涂片检测、培养以及鉴定对结核病的诊治有重要的临床价值。传统的痰涂片抗酸染色阳性率较低，L-J 固体培养法耗时较长，液体分枝杆菌培养法不能区分结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌。三者均不是较为理想的结核分枝杆菌实验室检测方法。为了满足临床需求，寻找一种适用于基层单位的简单快速的结核分枝杆菌检测鉴定方法显得十分迫切。

结核分枝杆菌培养物滤液蛋白64（MPB64）是对人致病的人结核分枝杆菌、牛结核分枝杆菌和非洲结核分枝杆菌等结核分枝杆菌复合群在菌群培养过程中分泌到菌体外的分子量为24 kDa 的特异性蛋白质，它是在牛结核分枝杆菌弱毒株BCG 中的培养液中首次分离的，而在非结核分枝杆菌复合群（NTM）中不形成MPB64［1］。本次研究利用结核分枝杆菌免疫胶体金法对该菌分泌的MPB64 蛋白进行检测，探讨MPB64免疫胶体金检测法在肺结核早期诊断中的应用价值。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 标本来源 收集2018年9月至2019年8月本院肺结核门诊和住院的经MGIT 960 液体分枝杆菌培养仪培养阳性的疑似新发肺结核患者210 例（所有收集标本均经过患者知情同意），所有培阳标本均经抗酸染色确认为抗酸性菌。其中，男147例，女63例，年龄最大83岁，最小16岁，平均年龄38.45岁。本地人口65例，流动人口145例。肺结核病根据卫生部发布的WS288.2017《肺结核诊断标准》［2］中临床症状、体征以及胸部影像学检查等确诊。

1.1.2 试剂和仪器 抗酸染液购自珠海BASO 生物技术有限公司，结核分枝杆菌抗原检测试剂盒（胶体金法）由杭州创新生物检控技术有限公司生产，液体分枝杆菌培养基、培养添加剂以及消化液均为美国BD 公司生产，固体中性罗氏培养基为上海疾控生物科技有限公司生产，以上试剂均由上海市疾病预防控制中心提供。液体分枝杆菌快速全自动培养仪为BD BACTEC MGIT 960，离心机型号为Heal Force Neofuge 1600。

1.2 方法

1.2.1 标本留取 患者留取即时痰、夜间痰和次日晨痰共3 次，涂片染色操作和质控方法参照《结核病诊断实验室检验规程》［3］进行。

1.2.2 标本培养 无菌取痰标本2.0 ml，加入事先准 备 好 的1～2 倍 体 积 的2% NALC-NaOH（N- 乙酰-L-半胱氨酸-NaOH）标本前处理液，强力旋涡振荡20 s 后室温静置15～20 min。然后加入pH 值6.8 磷酸盐缓冲液（PBS）至50.0 ml，3 000 g 离心15 min 后，再弃上清液，沉淀中加入1.0 ml pH 6.8的PBS制备成悬浊液。处理后取0.5 ml 标本接种至MGIT 960 培养管进行液体培养，接种完成后培养管上机检测。标本接种前，在MGIT 7.0 ml 培养管中事先加入0.8 ml 以Growth Supplement（生长添加剂）溶解后的PANTA（杂菌抑制剂）。

1.2.3 胶体金法检测 将液体培阳的标本全部进行涂片抗酸染色镜检，取确定为抗酸杆菌的标本0.1 ml 滴加入MPB64 免疫胶体金法检测板的加样区，15 min 后观察检测板的判定部，只有当检测线和质控线双方都确认出现紫红色条带方判定结果为阳性。在控制区出现紫红色条带，而在检测区未出现则为阴性结果。如果控制区未出现任何条带则需重新检测。

1.2.4 菌种鉴定 取液体培阳并经抗酸染色镜检确认为抗酸杆菌的培养液0.1 ml 接种到固体中性罗氏培养基中，210 例标本在固体培养基上均生长良好，待菌落生长占固体培养基斜面面积1/2以上时，将其送至上海市疾病预防控制中心结核病防治科进行PNB 法、TCH 法和28℃培养试验，并以其鉴定结果作为标准。

1.2.5 质量控制 抗酸染色质控涂片由上海市临床检验中心提供，室内质评为每周进行平行检测抗酸染色阴阳性质控片，结果均合格。室间质评（EQA）为定期随机涂片抽样送至上海市疾病预防控制中心参加盲法复检评估，各指标均合格。

1.3 统计学方法 采用SPSS 19.0 医学统计软件包进行χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。以上海市疾病预防控制中心菌群鉴定结果为标准，计算MPB64 胶体金法敏感性和特异性。敏感性（%）=MPB64 胶体金法检测出的MTC 感染例数/上海市疾病预防控制中心菌群鉴定的MTC感染例数×100%；特异度（%）=MPB64 胶体金法检测出的非MTC 感染例数/上海市疾病预防控制中心菌群鉴定的非MTC感染例数×100%。

2 结 果

210例液体培阳的标本经胶体金法检测后，检测结果与原患者痰直接涂片抗酸染色法结果对比见表1。涂片法的阳性率为48.57%（102/210），胶体金法的阳性率为90.00%（189/210），胶体金法与涂片法的阳性率差异有统计学意义，胶体金法的敏感性明显高于涂片法。

表1 胶体金法与痰涂片法比较（n=210）

将210 例液体培阳标本送至上海市疾病预防控制中心进行菌种鉴定，结果见表2。由表2 可见，经鉴定确诊为MTC 感染者有187 例，占比89.05%（187/210），非MTC 感染者23 例，占比10.95%（23/210）。胶体金法在初筛结核分枝杆菌复合群中的敏感性为97.86%（183/187），特异性为73.91%（17/23），准确度为95.24%（200/210），阳性预测值为96.83%（183/189），阴性预测值为80.95%（17/21）。

表2 胶体金法与金标准比较（例）

3 讨 论

肺结核是由结核分枝杆菌复合群引起的疾病，而非肺结核分枝杆菌病由于其临床表现与肺结核拥有相似的全身中毒症状和局部损害，经常被误诊为结核病而耽误疾病的诊疗［4］。肺结核的早发现、早确诊成为了当下结核病研究的热点之一。MPB64是结核分枝杆菌复合群分泌到菌体外的特异性蛋白质。本研究发现，在新发培阳的患者中，MPB64 胶 体 金 法 的 阳 性 率 为90.00%，高 于 张 涛 等［5］的83.25%（169/203），明显高于痰涂片直接抗酸染色法的48.57%。胶体金法阳性率之所以较高，考虑原因如下：作为结核分枝杆菌复合群分泌的特异性蛋白，MPB64 不论是在液体还是固体培养基中，或是在患者的痰液以及肺排泄物中都有存在的可能，且能指示分枝杆菌的早期生长［6］。本研究中，患者的标本已经经过了MGIT 960 液体分枝杆菌培养仪一定时间的培养，更是增加了MPB64 在液体培养物中的分泌量，从而提高了检出率。痰直接涂片抗酸染色镜检阳性率之所以较低考虑原因如下：阳性率和患者标本的留取质量有关，来自肺深部的干酪样痰、血痰、黏液痰等合格标本的检出率较高；每毫升痰标本中需要至少5 000～10 000 个抗酸杆菌才能检出；抗酸杆菌在患者体内不是连续性排出而是间隔性排出，也成为痰涂片法检出率不高的原因之一。

虽然胶体金法相较于痰涂片抗酸染色法在诊断肺结核方面阳性率高，但目前关于MPB64 的研究主要集中于其对结核分枝杆菌复合群菌种的鉴定。将液体培阳患者的标本进行胶体金法检测和上海市疾病预防控制中心菌种鉴定结果比较发现，MPB64 胶体金法在鉴别MTC 方面的敏感度为97.86%（183/187），和张涛等［5］将MGIT 960 液体培养得到的203 例分枝杆菌阳性菌株进行MPB64 抗原检测，免疫胶体金法97.70%（169/173）的敏感度相似，高于周刚等［7］在162例结核分枝杆菌阳性的临床标本的检测中，MPB64抗原检出率为95.70%的敏感度。但是，本研究中胶体金法的特异度为73.91%（17/23），相较于而张涛等［5］研究中100.00%的特异度偏低。本研究中4例MTC经MPB64胶体金法检测为阴性的可能原因如下：结核菌中mycobacterium bovis BCG的几个亚株（copenhagen 株、glaxo株、pasteur株、tice株）不产生MPB64［7］，所以判定为阴性；结核分枝杆菌培养物滤液蛋白64编码基因发生突变［5］，产生TGA 终止码，部分C末端区域缺失［8］，故而无法检测到MPB64；液体培养基出现阳性信号时，分支杆菌分泌的MPB64蛋白释放量不足［9］，尚未达到胶体金法的检出线。6 例诊断为非结核分枝杆菌复合群的菌株中胶体金法鉴定为阳性，可能是胶体金法为假阳性，也可能标本中存在微量结核分支杆菌，具体什么原因导致阳性有待进一步探讨。总体看来，MPB64 免疫胶体金法鉴定MTC时的准确度为95.24%（200/210）。

综上所述，在新发肺结核患者的诊断中，MPB64免疫胶体金法有较高的敏感性、特异性和准确度，胶体金法不仅仅可以明显提高抗酸杆菌的检出率，而且能够较为快速地鉴别结核分枝杆菌复合群，可弥补BACTEC MGIT 960 液体培养系统尚不能进行菌种鉴定的不足。MPB64免疫胶体金法已有成品试剂盒，15 min 可出检测报告，具有操作方便、快速、无须特殊仪器投入等多种优点，在结核分枝杆菌的快速检测方面拥有较好的应用前景，适合于各基层试验应用于肺结核病的早期临床诊断。

利益冲突：作者已申明文章无相关利益冲突。