宏基因组测序技术在儿童急性淋巴细胞白血病化疗后感染病原体检测中的应用

黎巧茹 李丽羽 赖文英 林春燕 朱蔼欣 陈琼 黄春辉

中山市人民医院普通儿科 528400

白血病是临床上常见造血系统恶性肿瘤，该病主要是由于白血病细胞在造血干细胞中异常增生，严重影响造血系统的正常运行，最终导致机体各组织和器官损伤［1］。儿童急性淋巴细胞白血病（ALL）是儿童白血病的主要类型，化疗是治疗该病的主要手段，但化疗药物对肿瘤细胞及人体内的正常细胞均有杀伤作用，导致体内白细胞急剧下降，易发感染，临床主要采用广谱抗生素来预防和治疗感染［2］。为了提高疗效，为骨髓移植争取时间，降低感染相关的病死率，及时有效地检测病原体极为重要。培养法是病原体检测的金标准，但分离培养周期长。随着高通量测序技术的发展，宏基因组测序技术逐渐用于病原体检测［3］。目前，国内主要采取的宏基因组测序技术二代测序对感染性病原体进行筛查。本文评价宏基因组测序技术检测ALL患者化疗后感染病原体的效果，结果如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取本院2018 年4 月至2019 年12 月间收治的120 例急性淋巴细胞白血病化疗后进入骨髓抑制期发热的患儿作为研究对象，男58 例，女62 例，年龄（5.2±1.4）岁（6 个月～13 岁）。本研究经本院医学伦理委员会批准。纳入标准：经GD-2008 ALL 诊断标准确诊为急性淋巴细胞白血病；经过常规化疗药物治疗；化疗后进入骨髓抑制期，有发热症状；患儿家属知情同意，并签署知情同意书。排除标准：合并心肺肾等功能障碍性疾病者；无法配合研究者；合并精神功能障碍者。

1.2 方法 所有患儿取肘静脉血，抽取10 ml 外周血，置于离心管中，3 000 r/min 离心10 min，取上清液置于无菌试管中，采用宏基因测序检测和培养法检测感染病原体。宏基因测序检测方法［4］：（1）核酸提取：取2 ml上清液，-80℃冷藏经武汉康圣达医学检验公司（武汉康圣达医学检验公司）提取核酸。（2）16SrDNA扩增：上游引物2 μl，Master 25 μl，DNA 模板2 μl，ddH2O 补至50 μl，进行预变性-变性-退火-延伸（30个循环）及电泳纯化。

另取上述2 ml上清液进行血培养检测［5］：将上清液置于全自动血培养仪孵育检测，仪器判读结果采用革兰氏染色法，紫色为革兰阳性菌，红色为革兰阴性菌，必要时将菌种接种在固体培养基上根据菌落的形态借助显微镜进行判断。

1.3 统计学方法 采用SPSS17.0统计分析软件对研究数据进行统计分析，计数资料以［n（%）］表示，再行χ2检验；计量资料比较使用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 宏基因组测序技术对病原体的检出率 培养法60例检出病原体，检出率50.0%，宏基因组测序技术76例检出病原体，检出率63.3%，宏基因组测序技术对病原体的检出率高于培养法，差异具有统计学意义（P＜0.05）。两种方法对细菌、真菌的检出率差异均无统计学意义（均P＞0.05），但宏基因组测序技术对病毒的检出率高于培养法，差异具有统计学意义（P＜0.05），见表1。

2.2 宏基因组测序技术检出病原体分布情况 培养法和宏基因组测序技术检出的病原体类型完全一致，但检出的病原体分布存在差异，宏基因组测序技术测得病原体分布高于培养法，但差异无统计学意义（P＞0.05），具体见表2。

表1 不同检测方法病原体检出情况比较[n（%）]

表2 不同检测方法检测出病原体分类情况（n）

3 讨 论

临床上急性淋巴细胞白血病患儿化疗后常发生感染，据报道急性白血病医院感染发生率为38%～80%，因感染死亡的概率达到4%，患儿的体液免疫及细胞免疫均受损［6-7］。所以诱导阶段感染率最高，严重威胁患儿的生命安全和生活质量，因此减少与感染有关的病死率对改善白血病预后水平有至关重要的作用［8］。而明确病原体感染类型，根据不同的感染病原菌选择合理的抗感染方案，缩短抗感染的疗程是提升临床疗效的有效手段，分离培养、免疫学抗原抗体反应等是目前临床上较为常用的检查病原菌的方法［3］。但这些方法存在阳性率低、周期长、对操作人员的技术水平要求比较高等缺陷，不被临床所推广，加之近年来随着病原体的变异、进化，抗生素的滥用等原因［9］，许多新型细菌和疑难感染病例不断增多，传统的检测方法已经无法满足目前的临床需要，因此高效的病原体检测方法对预防和治疗儿童急性淋巴白血病化疗后感染非常重要［10］。

近年来随着医学技术的不断发展，宏基因组测序技术越来越多的应用于医学研究和临床诊断中［11］，随着高通量测序技术的发展，众多感染性疾病的病原谱逐渐被公布，人们对病原体有了更多的认知［12］。本研究中宏基因组测序技术对病原体的检出率高于培养法（P＜0.05），其中对病毒的检出率显著高于培养法（P＜0.05），对细菌和真菌的检出率与培养法比较无统计学差异（P＞0.05），可见宏基因测序技术在检测出病原体的种类及数目方面均占显著优势，尤其是在病毒方面。Munang"andu HM 等［13］通过宏基因测序技术检测出204 例成年急性肝衰竭患者血清，出现8 例新病毒，同时鉴定出一些之前未被检测出的多重感染病例，表明宏基因组二代测序能够较好地检出低丰度的多重感染病原体，与本文研究结果相似。分析原因可能是培养法虽是鉴定病原体最直接的方法，但实际上很多细菌是培养不出来的［14］，而宏远测序是直接对样本的基因组进行测序，从而能迅速准确地对病原体进行鉴定［15］。Long Y 等［16］对78例ICU患者进行血浆宏基因组测序，并同时送检外周血培养，结果宏基因组测序方法的病原体检出率为30.77%，而血培养法仅为12.82%，与本文的研究结果相似。在病原体分型方面，培养法和宏基因组测序技术检出的病原体类型完全一致，表明不同类型的细菌、病毒和真菌，培养法和宏基因组测序均能有效检出，但检出能力不同。本研究中，宏基因组测序技术测得病原体分布高于培养法，但差异无统计学意义（P＞0.05），表明培养法无法检出的病原体，宏基因组测序技术能够检出，具有更高的检出效率。另外，本研究中，病原体分布统计的病例数高于检出例数，是因为部分患者合并多种病原体感染所致。

虽然宏基因组测序技术在临床上得到了广泛的应用［17］，但因为临床标本可能因为交叉感染而产生假阳性结果，高通量测序数据库不完善，数据分析过程复杂等多方面原因［18］，宏基因组测序技术在临床应用仍要面临很多问题，相信未来宏基因组测序技术将逐渐克服这些难题，进一步推动感染病学的发展［19］。

综上所述，相对于传统的病原学检测方法，宏基因组测序技术可提高病原菌的检出率，从而改善患者的预后，值得临床推广。

利益冲突：作者已申明文章无相关利益冲突。