光照周期对秸秆过滤前后牛场废水培养微藻的影响

王忠江，王贵祥，王子越，郑 宇，王丽丽，隋宇航

（东北农业大学工程学院，哈尔滨150030）

微藻富含蛋白质、油和多糖等有机物质，广泛应用于食品、药品、保健品、生物柴油、动物饲料和生物能源等方面[1-2]。随着全球能源问题日益严峻，微藻和大型藻类生物质作为满足燃料需求的替代品已受到学者关注[3]。然而，为满足微藻生长需求，培养过程需添加大量氮磷等化学药品，高成本限制微藻产业化发展[4]。我国畜禽养殖业在快速发展同时也产生大量以粪便为主的废弃物。根据中国畜牧业统计年鉴、国家环保部及国家统计局数据，2019年全国牛出栏数量为4 533万头，按照国家环保总局推荐排泄系数，预计产生33 097万t粪便和16 548万t尿液，畜禽养殖废水已成为国内仅次于钢铁和煤炭第三大污染行业[5]。处理畜禽排泄废水,净化和保护水资源已刻不容缓。Garcia等研究报道，含有大量氮、磷等营养成分的畜禽养殖废水可成为微藻培养潜在培养基质[6]。

但畜禽养殖废水作为微藻培养基质仍存在问题。由于畜禽养殖废水普遍存在浊度大、TSS过高、COD较大等问题，影响微藻培养过程光透过性，限制微藻生长。目前，利用废水培养微藻前通常利用沉降、离心、絮凝等方式预处理废水[7]，处理效果差处理成本高，限制微藻规模化培养。秸秆是一种天然聚合物，富含具有吸附能力的纤维素，具有处理废水潜质。粉碎后秸秆可过滤废水中杂质，有效降低TSS、TN、COD等指标[8]，目前利用秸秆过滤牛场废水并用于微藻培养的系统性对比研究鲜有报道。

因此，本文针对以上问题，以秸秆过滤前后牛场废水为原料，在添加比例为10%条件下，通过检测培养过程中微藻干重以及微藻培养液中氨氮、总氮、总磷和COD指标，系统研究不同光照周期条件下秸秆过滤后牛场废水用于微藻培养可行性及适宜培养条件。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 牛场废水预处理

试验采用牛场废水取自哈尔滨市后许家屯奶牛场，采用干清粪方式，废水中化学需氧量和氨氮等含量较高。秸秆取自东北农业大学生物质能源试验室，粉碎后备用。将粉碎后玉米秸秆（粒径10～40 mm）加入高50 cm，直径10 cm滤柱中，工作高度30 cm，适当压实（容重为0.1184 g·cm-3），底部用纱布封闭，从滤柱上方加入未经任何处理高浓度奶牛场废水（未滤），使其与秸秆充分接触，在滤柱下用烧杯收集过滤后废水，储存于4℃冰箱内备用。秸秆过滤前后牛场废水相关指标如表1所示。

表1 牛场废水特性Table 1 Characteristics of cattle farm wastewater

1.1.2 试验藻种

试验所用藻种为普通小球藻（Chlorella vulgaris）与肥壮蹄形藻（Kirchneriella obesa），均由中国科学院水生生物研究所提供，藻种编号为FACHB-8（8号藻种）和FACHB-2104（2104号藻种）。将微藻接入BG11培养基后于人工气候培养箱中预培养，培养温度（25±1）℃，光照强度2 500 lux，光暗比12 h∶12 h，通气量1.0 L·min-1，空气在进入培养液前经0.2μm滤膜过滤。

1.2 试验方法及条件

采用牛场废水和BG11培养基混合液培养微藻，牛场废水添加量为10%[9]，试验药品均为分析纯。利用OBY-Q600-SEI型人工气候培养箱（常州欧邦电子有限公司）培养微藻，培养温度（26±1）℃，光照强度4 000 lux，同时利用HG-180型旋涡式气泵（购自台湾亚士霸电机集团有限公司）向微藻培养液通入空气，通气量1.5 L·min-1，空气在进入培养液前经0.2μm滤膜过滤。

试验容器为1 000 mL三角瓶，工作体积700 mL，将对数期藻种各70 mL分别加入培养液中，每组3个重复，展开批式培养，培养周期14 d，每天取样测680 nm吸收波长下OD值和pH。每隔1 d取样，利用3-30 K型高速离心机在10 000 r·min-1条件下离心，测定上清液中氨氮质量浓度、总氮质量浓度、总磷质量浓度和COD值。

1.3 分析方法

生物量测定采用干重法。取小球藻藻液，将包含藻液样品放入预先干燥至恒重离心管（质量为M1）中，8 000 r·min-1离心机中离心10 min，去除上清液，将剩余样品再次烘干至恒重（M2），得到微藻生物质干重（m）。用紫外可见分光光度计测定其在680 nm吸收波长下OD值，确定所选微藻生物质干重与OD680间线性关系，衡量小球藻在培养过程中相对生长量。式（1～2）分别为两种微藻干重与OD680线性关系式：

干重（g·L-1）=0.2605 OD680+0.028（8号）

废水浊度采用分光光度法测定680 nm下吸光度；pH使用pH计（雷磁PHS-25）测定；黏度使用NDJ-9S旋转黏度计测定；TSS用重量法测定，参照GB11901-89《水质悬浮物的测定》[10]；培养液COD值测定采用重铬酸盐法；总氮采用凯氏定氮法（Kjeldahl method）测定，所用仪器为K9860型全自动凯氏定氮仪（济南海能仪器股份有限公司）；氨氮和总磷使用荷兰SKALAR连续流动分析仪测定；均参照《水和水质监测分析方法》（第四版）[10]。采用Origin 2018处理数据，SPSS 22.0分析差异显著性。

2 结果与分析

2.1 微藻生长

不同光照周期条件下，微藻干重值曲线如图1所示。

图1 微藻生长曲线Fig.1 Growth curves of microalgae

由图1可知，8号藻种可在秸秆过滤前后牛场废水中较好生长，各试验组干重值由试验开始时0.043～0.048 g·L-1升至0.445～1.044 g·L-1，且已滤组干重积累情况均优于未滤组，达极显著（P＜0.01）。而2104号藻种在秸秆过滤前后牛场废水中生长均较缓慢，各试验组干重值由试验开始时0.027～0.029 g·L-1升至0.096～0.248 g·L-1，试验开始前5 d未表现明显差异，从第6天开始，已过滤试验组干重值明显高于未过滤试验组，达显著（P＜0.05）。不同光照周期也对微藻生长产生显著影响，两种微藻随光照时间延长生长良好，8号藻种在光照周期24 h∶0 h和18 h∶6 h时，干重值极显著高于12 h∶12 h试验组（P＜0.01）。光照周期12 h∶12 h试验组表现更长适应期，第6天开始生长，试验结束时，干重值比24 h∶0 h试验组低57.4%。2104号藻种在不同光照周期条件下生长较缓慢，试验过程中表现较长适应期，试验结束时各试验组干重值较低，光照周期对2104号藻种生长影响显著（P＜0.05）。本试验中，各组微藻生长趋势符合生物学S型生长曲线，利用Origin 2018软件拟合各试验组微藻生长曲线，比较发现数据可较好符合DoseResp函数模型，该函数分为bottom asymptote、hill slope、top asymptote 3个过程，在不同试验条件下，各试验组干重积累量与培养时间关系拟合度R2均高于0.9910，经F检验，显示显著相关性（P＜0.01），各试验组拟合后方程如表2所示。

表2 微藻生长曲线拟合方程Table 2 Fitting equations of microalgae growth curves

2.2 微藻培养液pH

不同光照周期条件下，微藻培养液pH变化如图2所示。由图2可知，8号藻种中3个光照周期试验组差异较大，但变化趋势相似，均呈先快速上升，之后逐渐趋于稳定趋势，其中，24 h∶0 h试验组生长更好，pH在第6天时达到最高值9.41，略有下降，然后逐渐趋于平稳。而2104号藻种pH变化趋势一致，在试验前4 d逐渐上升，各试验组pH变化差异较小，第4天开始，各试验组pH差异逐渐显著（P＜0.05），之后逐渐趋于平稳。已过滤试验组pH在试验结束时维持在8.79～9.21，未过滤试验组pH在试验结束时维持在8.53～9.01，差异达显著（P＜0.05）。已滤组和未滤组pH均符合张丹等研究得出小球藻适宜生长在中性偏碱环境[11]。此外，各过滤试验组中24 h∶0 h试验组培养液pH在试验过程中均极显著高于18 h∶6 h和12 h∶12 h试验组（P＜0.01），是由于24 h∶0 h试验组微藻生长速率均优于其他试验组，对培养液中H+消耗更大，产生上述现象。

2.3 微藻培养液氨氮质量浓度

不同光照周期条件下，微藻培养液中氨氮质量浓度变化如图3所示。由图3可知，在试验前期，各试验组中氨氮质量浓度快速下降，随试验开展，微藻生长速率减缓，氨氮消耗速度减缓。试验结束时，8号藻种各试验组氨氮质量浓度由试验开始时251～296 mg·L-1降至0～23 mg·L-1，2104号藻种各试验组氨氮质量浓度由试验开始时253～297 mg·L-1降至2～41 mg·L-1。

由图3还可知，8号藻种在光照周期24 h∶0 h试验组中，氨氮去除率达到100%（已滤）和96.9%（未滤），而2104号藻种在光照周期24 h∶0 h试验组中氨氮去除率达到99.2%（已滤）和93.7%（未滤），其他两个光照周期条件下试验组氨氮去除率为86.2%～94.5%，两种微藻均在更长光照时间试验组中氨氮去除率更高，达极显著（P＜0.01），且两种微藻在已过滤试验组中氨氮去除效果均明显优于未过滤试验组，差异达极显著（P＜0.01）。结合微藻干重曲线图可知，光照时间短试验组中微藻干重值较低，但氨氮去除率也达到86.2%以上，可能是由于通气对培养液中氨氮有一定脱除作用，产生这种现象。

图2 pH变化Fig.2 Variation of pH

图3 氨氮质量浓度变化Fig.3 Variation of ammonia nitrogen concentration

2.4 微藻培养液总氮质量浓度

不同光照周期下，微藻培养液中总氮质量浓度变化见图4。可知，两种微藻在试验过程中均可较好去除培养液中总氮，各试验组中总氮质量浓度下降趋势一致，且与氨氮质量浓度下降趋势一致，是由于培养液中氨氮约占总氮含量90%。试验过程中，已过滤试验组和未过滤试验组中总氮质量浓度变化差异达极显著（P＜0.01）。试验结束时，8号藻种在各试验组中总氮质量浓度由试验开始时305～342 mg·L-1降至13～53 mg·L-1，2104号藻种各试验组中总氮质量浓度由试验初期301～411 mg·L-1降至21～51 mg·L-1，由此可知，两种微藻在试验过程中对总氮均有较好去除效果。此外，8号藻种在光照周期24 h∶0 h试验组中生长情况最佳，总氮质量浓度去除率也最高，达95.8%（已滤）和92.6%（未滤），而在12 h∶12 h试验组中，藻种生长较缓慢，总氮质量浓度去除率也较低，为85.2%（已滤）和84.5%（未滤），说明8号藻种在不同光照周期条件下总氮质量浓度去除情况存在显著差异（P＜0.05）。

2.5 微藻培养液总磷质量浓度

不同光照周期条件下，微藻培养液中总磷质量浓度变化如图5所示。

图4 总氮质量浓度变化Fig.4 Variation of total nitrogen concentration

图5 总磷质量浓度变化Fig.5 Variation of total phosphorus concentration

由图5可知，各试验组总磷质量浓度变化趋势一致，即试验开始时各组总磷质量浓度迅速下降，后期（12～14 d）趋于平稳，结合微藻干重曲线图，微藻生长情况较好试验组对培养液中总磷去除效果更好。试验结束时，8号藻种各组中总磷质量浓度由试验开始时8.29～11.79 mg·L-1降至0.015～0.97 mg·L-1，2104号藻种各组总磷质量浓度含量浓度由试验开始时8.47～11.67 mg·L-1降至0.015～0.93 mg·L-1。

由图5可知，未过滤试验组中总磷质量浓度在试验开始时均高于已过滤试验组，随试验进程，已过滤试验组中总磷质量浓度下降速度更快，试验结束时，已过滤试验组总磷平均去除率达97.8%以上，且已过滤试验组总磷去除率均显著优于未过滤试验组（P＜0.05）。此外，8号藻种和2104号藻种均在光照周期24 h∶0 h试验组中生长更好，对培养液中总磷去除效果也最好，去除率达99.8%，光照周期18 h∶6 h试验组对培养液中总磷去除率为96.7%～98.9%，而光照周期12 h∶12 h试验组中干重值相对较低，微藻生长较缓慢，培养液中总磷去除率为91.3%～92.7%，达极显著（P＜0.01）。

2.6 微藻培养液COD值

不同光照周期条件下，微藻培养液中COD值变化如图6所示。由图6可知，各试验组COD值变化趋势一致，即在试验前中期（前2～10 d）下降速度较快，试验后期趋于稳定。8号藻种各试验组中COD值由试验开始时965.27～1089.89 mg·L-1降至193.63～425.87 mg·L-1，2104号藻种各试验组中COD值由试验开始时968.17～1024.38 mg·L-1降至207.22～452.36 mg·L-1。由图中还可知，未过滤试验组中COD在试验开始时略高于已过滤试验组，随着试验进程，已过滤试验组中COD值下降速度更快，试验结束时，已过滤试验组COD值均明显低于对应未过滤试验组，已过滤试验组COD值去除率为61.6%～80.2%，而未过滤试验组COD值去除率则为55.2%～74.6%，差异达极显著（P＜0.01）。另外，两种微藻在光照周期24 h∶0 h试验组中COD去除率达73.1%～80.2%，而在光照周期18 h∶6 h和12 h∶12 h试验组中COD去除率分别为63.3%～74.4%和55.2%～67.3%，结合微藻干重值曲线图可知，微藻生长较缓慢试验组中，COD值下降速度也较缓慢，试验结束时COD去除率较低。

图6 COD值变化Fig.6 Variation of COD

3 讨论与结论

本文系统研究秸秆过滤预处理后牛场废水用于微藻培养可行性和培养液中有机污染物去除情况。研究发现过滤后试验组中两种微藻生长情况均优于对照组，采用秸秆过滤预处理方式显著降低奶牛场废水总悬浮固体和浊度，利于后续微藻生长，因处理成本低，可有效加快微藻培养与养殖废水处理工业化进程。由于牛场废水浊度较大，光透过率低，微藻培养过程中对光照要求高[12]，所以光照时间较长试验组微藻生长良好，与郭亚敏研究结果一致[13]。本研究8号小球藻生长情况优于2104号肥壮蹄形藻，是由于小球藻具有更好氮磷去除能力，更易在污水中形成生长优势，与胡洪营等研究结果一致[14]。微藻培养过程中，溶液pH升高，与Prajapati等研究中发现pH由7.8升至9.2规律一致[15]，由于微藻在生长过程中光合作用消耗污水中CO2，促进以下反应向右进行：HCO3－↔CO2+OH－，导致溶液pH上升[16]，而藻细胞合成也需大量H+、HPO42-等，造成溶液中H+浓度降低，且碱性水质环境也对有害菌起到一定消毒作用[13]，促进微藻生长。两种微藻在已过滤试验组中氨氮去除效果均优于未过滤试验组，是由于藻类在生长过程中优先利用溶液中氨态氮[17]，培养液中氨氮质量浓度在试验开始时便迅速下降，且氨态氮易挥发，通气对培养液中氨氮也起到一定脱除作用[18]，各试验组氨氮去除效果明显。试验组在试验结束时总氮去除率均达到84.5%以上，均优于王岩利用养殖场废水培养小球藻、栅藻、6803号微藻时总氮去除率[19]，因本研究采用秸秆过滤预处理方式显著降低奶牛场废水总悬浮固体和浊度，过滤后废水更利于后续微藻培养，微藻生长速率更高，对培养基质中氮素消耗量也更大。由于磷为合成微藻细胞重要组成元素[20]，而培养液中磷主要以HPO42-形式存在，对培养液中总磷有效去除说明这两种微藻均可利用溶液中磷元素，各试验组总磷质量浓度去除率均达91%以上，与Prajapati等在研究过程中总磷去除率相近[15]。在微藻培养过程中，微藻细胞与污水中细菌构成藻菌共生体[21]，微藻光合作用时释放O2可促进污水中有机物分解，培养液中通入空气还可增强未灭菌奶牛场废水中好氧微生物活性，促进微生物对培养液中有机物分解和利用[22]，使培养液中COD值降低，试验结束时，各试验组培养液中COD去除率相对较低，是因微藻细胞存在分解，与张红红研究结果一致[23]。在较长光照时间条件下，微藻生长更好，对培养液中COD去除效果更好，由于微藻以CO2为碳源光合作用同时，也利用培养液中各种有机化合物作为碳源异养生长，与王忠江等研究结果一致[24]。秸秆过滤预处理方式对场废水相关指标具体影响规律有待进一步探究。

综上，本文对比秸秆过滤前后牛场废水培养微藻生长情况及有机污染物去除情况；系统研究光周期对微藻生长影响，光周期对微藻Chlorella vulgaris和Kirchneriella obesa在混合牛场废水培养基质中生长影响显著，且前者适应能力优于后者；利用牛场废水培养微藻，可显著去除牛场废水中氨氮、总氮、总磷和COD；利用DoseResp函数拟合微藻干重曲线得到不同试验条件下微藻生长动力学方程（见表2）；为后续养牛场废水规模化培养微藻提供理论基础和预测模型。