两种野豌豆属植物叶片形态结构及其生态适应性研究

许少祺，刘浩地，李 雪，吴青松，张友民*

（1.吉林农业大学园艺学院，长春130118；2.松原市哈达山水利枢纽工程管理服务中心，吉林 松原138000）

山野豌豆（Vicia amoena）与大叶野豌豆（V.pseudo-orobus）隶属豆科（Fabaceae）蝶形花亚科（Papilionatae）野豌豆族（Trib.Vicieae）野豌豆属（Vicia），为多年生草本，植物资源丰富，耐瘠薄，再生力强，在农业上不仅多用作优良牧草和改土肥田作物，且可作为蜜源、草坪与水土保持植物，是珍贵的药用植物，同时由于其花色艳丽，花期较长，亦可作园林观赏植物，在我国农业系统中发挥重要作用[1-2]。世界野豌豆属植物约有200余种，我国现有40余种，主要分布于华北、西北、西南和东北地区，多生长于山坡、草甸、灌丛或林缘等环境中，因其具有产量高、生育期短和种子粗蛋白含量高等特点，广受科研人员重视，应用前景广阔[3]。近年来，针对该属植物研究多集中于分类学[4]、分子[5]、生理[6]和化学[7]等方面，但对其叶片解剖结构研究较少，关于其叶片形态结构与生态适应性关系研究尚未见报道。

叶片作为植物直接接受光照器官，其外部形态特征及内部解剖结构因环境改变表现差异。形态特征作为植物分类主要标准和依据发挥不可代替作用，研究叶片解剖结构与环境适应性是保护该植物基础，具有重要意义[8]。叶片表皮气孔是影响植物光合、呼吸及蒸腾作用主要因素，常用气孔密度与指数等变化分析环境对植物生长影响[9]。因此，本文以山野豌豆和大叶野豌豆叶片为供试材料，运用扫描电镜技术、植纹鉴定技术和石蜡切片法，系统研究其形态结构与解剖学，深入探究其演化关系及抗旱性、抗虫性与抗寒性，为更好保护野豌豆属植物资源、人工选育和园林应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验地概况与试验材料

供试材料采自长春市净月潭林缘（43°66′N，125°48′E，海拔高度约300 m）。试验地属温带大陆性季风气候，年均气温4.8℃，最高温度39.5℃，最低温度-39.8℃，年均日照时数2 688 h，年均降水量522～615 mm，无霜期140 d。选取长势良好山野豌豆和大叶野豌豆自顶端叶片下数第五片成熟叶片为样品，沿主脉将叶片剪成长方形（0.5 cm×1.0 cm），放入FAA固定液中保存。

1.2 方法

1.2.1 扫描电镜技术

将叶片放入101A-1ET电热鼓风干燥箱60℃条件下干燥36 h后裁成正方形（0.5 cm×0.5 cm），使用双面胶将叶片下表皮朝上粘于样品台，后用ETD-2000离子溅射仪导电处理，溅射镀膜厚7～8 nm，在Shimadzux-550扫描电子显微镜下观察并拍照[4]。

1.2.2 植纹鉴定技术

使用表皮撕取法制取植纹并鉴定[10]。分别撕取叶片上下表皮，平放于载玻片上，使用刀片轻轻刮去残留叶肉细胞，滴入固绿，1/2无水乙醇＋1/2二甲苯溶液冲洗，中性树胶封片，放入35℃恒温箱中保存，在Motic Panthera i生物显微镜下观察，Motic Imags Plus 3.0 ML拍照与测量。

1.2.3 石蜡切片法

使用常规石蜡切片法切片，切片厚度12μm，番红—固绿复染，中性树胶封片，制成永久封片，放入35℃恒温箱中保存[11]。所得样片用Motic Panthera i生物显微镜观察，Motic Imags Plus 3.0 ML拍照和测量。

1.3 数据测量与分析

本文术语依据Dilcher[12]和陆静梅[10]研究。由于两种野豌豆气孔主要分布于下表皮，因此本文相关数据为测量下表皮数值。每个样片相同倍数下随机取10个完整视野下测量，Excel 2019计算，SPSS 20.0相关分析，并计算以下参数：

气孔长宽比=气孔长度/气孔宽度；

气孔指数（%，SI）=气孔数/（气孔数＋表皮细胞数）×100%；

气孔密度（SD）=气孔数/视野面积；

栅海比=栅栏薄壁组织厚度/海绵薄壁组织厚度；

细胞结构紧密度（%，CTR）=（栅栏薄壁组织厚度/叶片厚度）×100%；

细胞结构疏松度（%，SR）=（海绵薄壁组织厚度/叶片厚度）×100%；

叶脉突起度（%，VPD）=（主脉直径/叶片厚度）×100%。

2 结果与分析

2.1 表皮特征

山野豌豆和大叶野豌豆叶片下表皮气孔突出，角质层纹饰存在差异。其中，山野豌豆角质层纹饰为线状、颗粒状，无表皮毛；大叶野豌豆角质层纹饰为线状、脊状，具单细胞表皮毛。扫描电镜照片见图1。

图1 两种野豌豆属植物叶片下表皮特征Fig.1 Characteristics of leaf lower epidermis of two Vicia species under scanning electron microscope

2.2 植纹鉴定

2.2.1 植纹特征

如图2所示，两种野豌豆叶片表皮植纹特征为：上、下表皮均有气孔，但主要分布于下表皮，为无规则椭圆形，仅有保卫细胞，无副卫细胞，在肾形保卫细胞周围环绕不规则表皮细胞。由表1可知，山野豌豆气孔长度和宽度，保卫细胞长度、宽度、周长和面积以及表皮细胞周长和面积均明显大于大叶野豌豆，气孔长宽比为4.09，气孔指数为31.55%，气孔密度为110.55个·mm-2，表皮细胞垂周壁类型为：浅波状、C型；大叶野豌豆气孔长宽比为4.37，气孔指数与气孔密度较大，分别高达34.67%和169.98个·mm-2，表皮细胞垂周壁类型为深波状、F型。

表1 两种野豌豆属植物叶片下表皮植纹特征Table 1 Characteristics of leaf lower epidermal plant print of two Vicia species

图2 两种野豌豆属植物叶片下表皮植纹特征Fig.2 Characteristics of leaf lower epidermal plant print of two Vicia species under biological microscope

2.2.2 植纹特征相关分析

如表2和3所示，使用Pearson相关系数分别分析山野豌豆和大叶野豌豆叶片下表皮植纹特征6个参数：保卫细胞长度（GL）、保卫细胞宽度（GW）、保卫细胞周长（GP）、保卫细胞面积（GA）、表皮细胞周长（EP）、表皮细胞面积（EA）多变量相关性发现：两种野豌豆部分植纹特征间关联方向与关联程度存在差异。

其中，山野豌豆表皮细胞周长和表皮细胞面积间相关系数r=0.938μm，差异极显著，即具有极显著线性正相关关系（P＜0.01）；大叶野豌豆气孔保卫细胞周长和保卫细胞面积间相关系数r=0.953μm，差异极显著，即具有极显著线性正相关关系（P＜0.01），表皮细胞周长和表皮细胞面积间相关系数r=0.651μm，差异显著，即具有显著线性正相关关系（P＜0.05）。

表2 山野豌豆叶片下表皮植纹特征相关分析Table 2 Correlation analysis of leaf lower epidermal plant print characteristics of V.amoena

表3 大叶野豌豆叶片下表皮植纹特征相关分析Table 3 Correlation analysis of leaf lower epidermal plant print characteristics of V.pseudo-orobus

2.3 叶肉解剖结构特征

在叶片横切面上，山野豌豆和大叶野豌豆叶片均由表皮、叶肉和叶脉三部分组成，其中，叶肉薄壁组织分化为栅栏薄壁组织和海绵薄壁组织，为典型异面型叶。两种野豌豆叶片上、下表皮均由单层细胞组成且外被角质层，上表皮细胞长柱形，下表皮细胞近球形；表皮细胞大小不一、排列紧密；栅栏薄壁组织由1层长柱形薄壁细胞构成。山野豌豆叶片上下表皮、栅栏薄壁组织与海绵薄壁组织中有较多后含物，表皮细胞较薄，栅栏薄壁组织较薄，排列稀疏，海绵薄壁组织略薄，胞间隙明显，栅海比为1.17，细胞结构疏松度高于大叶野豌豆，为34.81%；大叶野豌豆叶片、角质层和表皮细胞较厚，栅栏薄壁组织与海绵薄壁组织中偶见后含物，栅栏薄壁组织发达，排列紧密，海绵薄壁组织较厚，胞间隙较小，栅海比和细胞结构紧密度分别高达1.38和45.38%，均明显大于山野豌豆（见图3，表4）。

表4 两种野豌豆属植物叶片解剖结构特征Table 4 Characteristics of leaf anatomical structure of two Vicia species

图3 两种野豌豆属植物叶片解剖结构Fig.3 Leaf anatomical structure of two Vicia species under biological microscope

2.4 主脉解剖结构特征

在生物显微镜下，山野豌豆和大叶野豌豆叶片主脉发达，由机械组织、基本组织和维管束组成，在下表皮呈圆弧状隆起；维管束个数均为1，由位于近轴面近心形初生木质部和远轴面半环状初生韧皮部组成，维管束鞘呈环状，山野豌豆叶片主脉维管束鞘较明显。

由表4可知，山野豌豆叶脉突起度为281.17%，大叶野豌豆叶片主脉和维管束直径分别为528.41和301.97μm，均明显大于山野豌豆，导管和筛管直径也较大，叶脉突起度高达387.17%（见表4，图4）。

图4 两种野豌豆属植物主脉解剖结构特征Fig.4 Main vein anatomical structure of two Vicia species under biological microscope

3 讨论与结论

植物外部形态和内部结构与其生存环境关系紧密，山野豌豆和大叶野豌豆可在山坡、草甸、林缘等瘠薄环境中维持正常生长，是因其对该生境具有一定适应能力。本文研究的两种野豌豆因隶属于同一科属，在叶表皮、叶肉和主脉方面结构特征既有相似之处，亦存在不同。

3.1 演化关系及其抗旱性、抗虫性

植纹是植物表观纹理，具有独特性与排他性，因此植物叶片表观结构可作为植纹鉴定依据[10]。吴叶等认为，植物叶表皮微形态特征可为属内种分类和系统演化提供理论依据[13]。叶表皮气孔与植物光合作用密切相关，密集气孔有助于植物体与外界气体交换，进而促进光合效应[14]。陆嘉惠等研究表明，叶表皮细胞垂周壁式样演化趋势为平直-弓形到浅波状，再到深波状；气孔密度和气孔指数可映射植物对干旱环境适应性，二者呈正相关，二者值越大，植物抗旱能力越强[15]。赵重阳等认为气孔长宽比值反映气孔形态特征，同属不同种间比值大的有进化表现，可作为判断植物种间进化程度依据[16]。本研究结果表明，在两种野豌豆叶片表观结构中，气孔类型均为无规则型，但表皮细胞垂周壁镶嵌类型不同，山野豌豆和大叶野豌豆垂周壁式样分别为浅波状和深波状，表现为C型和F型，且大叶野豌豆气孔密度、气孔指数和气孔长宽比均较大，此种间差异可作为鉴定野豌豆属植物依据之一。由此推断，山野豌豆叶片表现较原始，大叶野豌豆叶片表现较进化，抗旱性较强，这也与雒宏佳等研究结果一致[17]。同时分析二者叶片表皮植纹特征参数相关性发现，两种野豌豆部分植纹特征间关联方向与关联程度不同，将表观结构特征量化是对传统植物分类方法的补充与完善。

植物叶片上下表皮细胞外壁被角质层，增强不透水性，可防止植物体内水分过分蒸腾，角质层还具有机械支撑作用，避免植株在水分供应不足时立即萎蔫，提高机体对炎热干旱环境耐受能力，同时折光性较强，可防止紫外线对植物造成光化学伤害，表皮细胞和角质层越厚，抗旱性越强[18]。本研究发现，两种野豌豆叶片表皮细胞排列紧密而整齐，可减少体内水分蒸腾，叶片上下表皮均被角质层，且气孔主要分布在下表皮，是对强光和缺水环境长期适应结果。其中，山野豌豆叶片角质层略薄；大叶野豌豆表皮细胞和角质层较厚，两种野豌豆均具有一定抗旱能力，但综合比较，大叶野豌豆更适应干旱强光环境，抗旱能力较强。

刘一华认为表皮毛作为天然物理屏障，可有效预防虫害、食草动物伤害和寄生植物危害[19]。赵延霞研究表明，叶片下表皮细胞越厚，组织结构紧密度越大，抗虫性越强[20]。本研究发现，山野豌豆下表皮无毛，表皮细胞较薄；大叶野豌豆下表皮具单细胞表皮毛，表皮细胞较厚，组织结构紧密度较大，推测其抗虫性强于山野豌豆。

3.2 叶肉结构及其抗旱性、抗寒性

叶肉是叶片光合作用主要部位，在叶肉薄壁组织中，栅栏薄壁组织和海绵薄壁组织厚度差异直接影响叶绿体分布和光合作用效率，二者分化程度可间接反映环境中水分状态及光照变化，栅海比越大，植物抗旱能力越强，反之则弱[21]。对两种野豌豆叶片横切发现，二者叶肉中后含物使其表现出耐旱特征[22]。郭学民等认为，栅海比、细胞结构紧密度与抗寒性呈正相关，细胞结构疏松度与抗寒性呈负相关[23]。山野豌豆较薄的栅栏薄壁组织及疏松的海绵薄壁组织，对较弱光照或中生、湿生环境适应，耐阴性较强；大叶野豌豆较厚叶片、发达栅栏薄壁组织、排列紧密海绵薄壁组织、较厚角质层和下表皮单细胞表皮毛，且因其栅海比和细胞结构紧密度较大，细胞机构疏松度较小，推测其抗旱性与抗寒性较强。

3.3 主脉结构及其抗旱性、抗寒性

主脉在叶片中发挥支持与输导作用，主脉及其维管束发达程度直接影响水分的输导效率，反映植物抗旱性[24]。维管束鞘也有助于水分传输，可增强光合作用，抵御不良环境因子胁迫[25]。研究认为，叶脉突起度与抗寒性呈正相关，即叶脉突起度越大，叶脉维管组织加快物质运输能力，补偿更多失水，植物抗寒性越强[26-27]。本研究发现，两种野豌豆叶片主脉维管束发达，薄壁组织和多层厚角组织有助于贮藏营养物质与水分，提高叶片支撑力，适应瘠薄环境，增强自身抵抗恶劣环境能力。其中，山野豌豆维管束鞘明显，说明其具有抵抗干旱胁迫能力；但大叶野豌豆主脉及维管束较发达，可显著提高其输水效率，说明其更适应干燥环境，且由于其叶脉突起度较大，说明其具有抗寒特征，推测其抗寒性较强。

综上所述，山野豌豆叶片表现较原始；耐阴性较强。大叶野豌豆叶片表现较进化；抗旱性、抗虫性与抗寒性较强。两种野豌豆属植物经强日照辐射、干旱贫瘠和寒冷等环境长期作用，其叶片形成一系列适应结构特征。因此，对研究植物叶片形态结构及其生态适应性评价具有重要价值，将山野豌豆和大叶野豌豆作为园林植物，根据二者生态适应性将其种植于不同环境，应用前景十分广阔。