固相萃取-气相色谱-串联质谱法测定大豆油中126 种农药残留

汪春明, 张 洋, 王东斌, 施鹏斐, 杨 波

(中国检验检疫科学研究院 综合检测中心，北京 100123)

为了更有效地规范食用植物油中农药残留限量，联合国粮食及农业组织 (FAO)、世界卫生组织 (WHO)、欧盟、日本、美国等国家或组织都有农药残留限量的规定，中国国家标准中对食用植物油中农药残留的限量也有明文规定[1-2]。大豆油中农药残留检测之关键在于高含量的甘油及亲脂性干扰物的存在，脂质类干扰物会在色谱柱和仪器中积聚，从而缩短色谱柱及仪器的使用寿命[3]；此外，由于离子抑制从而导致被分析物灵敏度下降，现有的检测方法在去除油脂的同时会损耗一部分目标物。为了兼顾除去油脂和提高目标物回收率，本研究选择增强型脂质去除产品Captiva EMR-Lipid 固相萃取柱，对比传统的固相萃取柱，以验证其在大豆油农药残留分析中的可行性。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Agilent 9000-7000 气相色谱-串联质谱；HP-5MS UI 气相色谱柱 (30 m × 0.25 mm，0.25 μm)(美国Agilent 公司)；SR-2DS 振荡器 (日本TAITEC 公司)；移液枪 (德国Eppendorf 公司)；EVA50A 氮吹仪 (中国普立泰科公司)；CR21N 离心机 (日本HITACHI 公司)；VORTEX GENIE 2 涡旋混匀器 (美国Scientific Industries 公司)；XS105&PL303 分析天平 (瑞士METTLER TOLEDO公司)；VISIPREP DL 固相萃取装置 (美国SUPELCO公司)；Milli-Q 超纯水系统 (美国Millipore 公司)。

126 种农药标准品 (见表1，纯度 ≥ 95%，Dr Ehrenstorfer，德国)；正己烷、乙腈和乙酸乙酯(色谱纯，美国Fisher 公司)；氯化钠 (分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；试验用水为Milli-Q 超纯水；Agilent Bond Elut 弗罗里硅土固相萃取柱 (FL，1 g，6 mL)；Agela 中性氧化铝固相萃取柱 (AL-N，1 g，6 mL)；Waters Oasis HLB 固相萃取柱 (150 mg，6 mL)；Agilent 增强型脂质去除固相萃取柱 (Captiva EMR-Lipid，1 g，6 mL)；Waters Oasis PRiME HLB 固相萃取柱 (60 mg，3 mL)；Waters Oasis PRiME HLB Short 固相萃取柱 (335 mg)；Supelclean 硅胶固相萃取柱 (LC-Si，1 g，6 mL)；Supelclean C18固相萃取柱 (ENVI-18，1 g，6 mL)；Agela Cleanert PEP 固相萃取柱 (200 mg，3 mL)。

试验样品来源：中国检验检疫科学研究院综合检测中心样品间。

1.2 样品前处理

称取5 g 样品，以10 mL 用乙腈饱和的正己烷溶解并轻轻摇匀，加入10 mL 用正己烷饱和的乙腈，振荡10 min 后于 -5 ℃、20 000 r/min 下离心5 min；取下层乙腈相于50 mL 离心管中，以10 mL正己烷饱和的乙腈振荡提取10 min 后于-5 ℃、20 000 r/min 下离心5 min；合并两次提取液，混匀；取6 mL 乙腈提取溶液，加入1.5 mL 一级水混匀，分两次全部转移到Captiva EMR-Lipid 固相萃取柱中 (事先分别用5 mL 乙腈、5 mL 一级水活化)，Captiva EMR-Lipid 固相萃取柱下接内含1.0 g氯化钠的15 mL 离心管，当待测物流至近干后用吸耳球吹干；流出液 (约7.5 mL) 涡旋30 s，静置分层；取4 mL 上层乙腈溶液，于40 ℃下氮气吹至近干，用1.0 mL 乙酸乙酯复溶，待气相色谱-串联质谱检测。

1.3 标准溶液配制

1.3.1 标准储备溶液 分别准确称取不低于10 mg各农药标准品于10 mL 容量瓶中，用丙酮溶解并定容，得到适当浓度的标准储备液。

1.3.2 混合标准溶液 按照农药的性质和保留时间，将126 种农药分为A、B 两组，详见表1。准确吸取合适的标准储备液于10 mL 容量瓶中，得到10 mg/L 混合标准中间溶液，之后再逐级稀释为1.0 mg/L 混合标准溶液。

1.3.3 基质匹配标准溶液 准确吸取适量1.0 mg/L各农药混合标准溶液，用乙酸乙酯逐级稀释成质量浓度为0.003、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2 mg/L 的系列标准工作溶液。选择不含目标农药的大豆空白样品，按1.2 步骤处理得到空白基质溶液。取1 mL 空白基质溶液用氮气吹干，分别准确加入 1 mL 上述标准工作溶液复溶，即得到系列基质匹配混合标准工作溶液。

表1 126 种农药保留时间及气相色谱-串联质谱检测参数Table1 Retention time and GC-MS/MS detection parameters of 126 pesticides

续表 1Table1 (Continued)

续表 1Table1 (Continued)

1.4 检测条件

气相色谱条件：初始温度60 ℃，保持1.0 min，以40 ℃/min 升至170 ℃不保持，以10 ℃/min 升至310 ℃保持3.0 min；进样口温度280 ℃；进样量1.0 μL；载气为氦气，流速为1.0 mL/min。

质谱条件：电子轰击离子源 (EI)；电子能量70 eV；接口温度为280 ℃；离子源温度为280 ℃；四极杆温度为150 ℃；溶剂延迟3.0 min；扫描模式为多反应监测 (MRM)，定量定性离子对及碰撞能量见表1。

1.5 添加回收试验

根据《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》[1]中规定油料和油脂中农药的最大残留限量基本在0.005 mg/kg 以上，为了更好地满足最大残留限量需求，本研究向大豆油中准确添加混合标准溶液的最低添加水平为0.005 mg/kg (其中113 种按0.005 mg/kg 添加，12 种按0.01 mg/kg 添加，生物苄呋菊酯按0.05 mg/kg 添加)，并分别选择其1、2 和10 倍3 个水平添加标准混合溶液，每个水平重复6 次。按1.2 节和1.4 节的条件进行前处理和测定，计算平均回收率和相对标准偏差(RSD)。

1.6 基质效应

基质效应对气相色谱的影响普遍存在，比较相同浓度的农药，其在基质溶液中的色谱峰响应值会比其在纯溶剂中的高。基质效应的存在，一方面可以减少热不稳定农药的分解，以及屏蔽进样口的活性位点而减少农药在活性位点的吸附，增加目标化合物从进样口到色谱柱的浓度[4-6]；另一方面由于质谱检测是将物质离子化，在磁场 (或电场) 作用下按离子的质荷比分离来定性和定量，在基质效应的存在下，共流出组分会改变待测物的离子化效率和离子成分的组成，进而引起待测物检测信号的变化[7-8]，影响方法的灵敏度和检出限，因此有必要对基质效应进行评价。本研究采用提取后加入法和绝对基质效应法评价基质效应，通过测定目标化合物在基质匹配标准溶液中的响应值 (A) 及其在纯溶剂中的响应值 (B)，根据公式 (1) 计算基质效应 (Me)。当Me＜ 15 % 时，基质效应对结果的影响可忽略；当Me≥ 15% 时，基质效应对结果的影响不可忽略[9-10]。

2 结果与分析

2.1 MRM 方法的建立

2.1.1 确认保留时间及母离子 以MS1 scan 模式运行标准样品，在MassHunter 定性分析软件中积分并提取质谱，辅以NIST 数据库确定目标化合物及其保留时间，选择质量数相对更大、丰度更高的特异性离子作为母离子。

2.1.2 确认子离子及最佳碰撞能量 选择时间片段，将质谱扫描类型改为产物离子扫描 (production)，输入母离子、低质量数离子、高质量数离子及不同的碰撞能量后运行标准品以确定子离子和最佳碰撞能量。

2.1.3 优化峰形、确认MRM 方法 根据目标化合物的保留时间、特征离子对及最佳碰撞能量创建MRM 方法，运行混合标准样品并记录各化合物的峰宽，依据MRM 方法各分段的总时间，结合目标化合物的峰宽来调节每个transition 的驻留时间，确保每个化合物峰上有20 个左右的采样点。在MassHunter 软件中查看峰形和灵敏度，确认方法。优化后的结果见表1。大豆油中126 种农药在动态多反应监测模式扫描下的总离子流图见图1。

2.2 前处理条件的优化

2.2.1 提取溶剂的选择 农药残留检测过程中常用的提取溶剂有丙酮、正己烷、乙酸乙酯、乙腈、酸化乙腈及其不同比例的混合溶剂，其中乙酸乙酯和丙酮作为提取溶剂在提取脂肪含量高的样品时共萃取物多，增加了后续样品净化的难度。考虑到有些农药在酸性环境中不稳定，导致农药回收率降低，本研究采用不经过酸碱调节的用正己烷饱和的乙腈作为提取溶剂。在提取前，先用乙腈饱和的正己烷溶解样品，以便使溶解在乙腈中的油脂尽可能少[3]。本研究发现，在提取过程中加入氯化钠也会使油脂分配到乙腈相的比例大大减小，但在后续应用过程中发现，有些样品加入氯化钠后，乙腈与正己烷不能准确分层。综合考虑，在前处理过程去掉氯化钠。

2.2.2 固相萃取柱的筛选 为了更好地对比不同SPE 柱除去油脂的净化效果，本研究选取5 个大豆油空白样品，准确称取5 g，加入1.0 g 氯化钠、以10 mL 用乙腈饱和的正己烷和20 mL 用正己烷饱和的乙腈，振荡10 min，于 -5 ℃、20 000 r/min 下离心5 min。分别取这5 个样品的乙腈层于一个洁净容器中，混合均匀后分别准确移取其5 mL，加入至事先用10 mL 乙腈活化但不流干的FL、AL-N、HLB、PRiME-HLB、PRiME HLB Short、LC-Si、ENVI-18、PEP 和Captiva EMRLipid 固相萃取柱中；其中Captiva EMR-Lipid 使用方式与其他SPE 柱有所不同，使用前先用5 mL乙腈和5 mL水活化，在加入之前，加入1.25 mL 一级水与其混合均匀 (Captiva EMR-Lipid 柱需要有机相与水体积比为4 : 1 时，才能充分发挥Captiva EMR-Lipid 柱的功效)。净化液接收于接收管，接收之前准确称取接收管的质量；乙腈提取液过所有SPE 柱时采用1 滴/s，流至近干时，用吸耳球吹干残留在固相萃取柱上的乙腈提取液；将净化液在40 ℃水浴中，氮气吹至近干；记录不同接收管的质量，计算前后差值；用1.0 mL 乙酸乙酯溶解，待气相色谱-串联质谱测定。

结合接收管前后剩余油滴 (图2) 和气相色谱-串联质谱用2.2.2 节的方法结合1.4 节的仪器条件(检测模式改为MS1 SCAN)，对不同种类固相萃取柱净化后空白样品色谱图 (图3) 进行对比。综合分析得知，AL-N 和Captiva EMR-Lipid 净化效果最好。为了进一步比较AL-N 和Captiva EMR-Lipid的区别，作者对其做了添加回收试验，添加水平为0.02 mg/kg，其中溴螨酯、邻苯基苯酚、乙酯杀螨醇、速灭磷、丙溴磷过AL-N 柱后没有回收或回收率低，加之Captiva EMR-Lipid 的基质响应值高于AL-N。因此选用Captiva EMR-Lipid 固相萃取柱作为净化材料。

2.3 方法的线性范围及检出限

结果表明：在0.003～0.2 mg/L 范围内，126 种农药的质量浓度与其对应的峰面积之间线性关系良好，R2均大于0.995。

筛选经1.2 节前处理且信噪比低于3 的样品作为空白，以信噪比等于或大于10 作为方法的定量限 (LOQ)，其LOQ 在0.005～0.05 mg/kg 之间。

添加回收试验结果表明：126 种农药的平均回收率在60%～119%之间，其中122 种农药的RSD低于20%，另外4 种农药的RSD 低于25%。

2.4 基质效应

结果表明：总体上表现为明显的基质增强效应，其中：1) 氯苯胺灵和内吸磷存在基质减弱效应 (Me在-65%～16%之间)，而且随着添加浓度的增加，减弱的基质效应逐渐变得不明显；2) 醚菌酯在0.005 和0.01 mg/kg 添加水平下表现为基质减弱效应，在0.05 mg/kg 水平表现为基质增强效应；3) 有122 种农药表现为明显的基质增强效应；4) 有83 种农药在添加水平0.05 mg/kg 的基质效应弱于0.005 和0.01 mg/kg，可见当添加浓度增加后，基质效应会相应的减弱。因此本研究采用基质匹配标准溶液进行了校正。

2.5 实际样品测定

利用所建立的方法对企业送检和市场随机抽检的15 批大豆油样品进行了农药多残留检测。结果均未检出本方法所涉及农药残留的存在。

3 结论

优化了大豆油中农药残留的前处理方法，利用增强型脂质去除产品Captiva EMR-Lipid 固相萃取柱，结合GC-MS/MS 多反应监测模式 (MRM)，建立了大豆油中126 种农药残留的检测方法。结果表明：Captiva EMR-Lipid 固相萃取柱能够有效除去甘油及亲脂性干扰物，大豆油脂质成分含量高，基质效应明显，当大豆油中所含农药质量浓度较低时基质效应越明显，采用基质匹配标准溶液进行校正能够使结果更加准确。运用本方法对实际样品进行农药多残留检测，并未检出本方法所涉及农药残留的存在。