甲基硫菌灵和百菌清浸苗防治甘薯黑斑病的影响因素分析

张德胜, 白瑞英, 乔 奇, 田雨婷, 王永江, 王 爽, 张振臣

(河南省农业科学院 植物保护研究所，河南省农作物病虫害防治重点实验室，农业农村部华北南部作物有害生物综合治理重点实验室，郑州 450002)

甘薯黑斑病由甘薯长喙壳菌Ceratocystis fimbriata Ellis et Halsted 侵染甘薯引起，整个生育期均可感病，每年由该病造成的产量损失为5%～10%，是甘薯的主要病害之一[1]。带菌苗的栽插和运输是该病传播的重要途径[1]，生产中的引种不规范会进一步加重该病的蔓延[2]。使用杀菌剂浸苗是防控甘薯黑斑病的重要手段，中国建国初期应用较多的硼砂、氯化汞、醋酸苯汞、波尔多液等已被更加高效安全的药剂代替[3-5]。在中国除已登记的甲基硫菌灵等4 种杀菌剂外[6]，三唑酮、粉唑醇、噁霉灵、异菌脲和百菌清等也被证实对甘薯黑斑病有明显防治效果[7-9]。在世界其他甘薯产区，噻菌灵、苯醚甲环唑、氟啶胺等被报道对甘薯黑斑病有较好防治效果[10-12]。上述杀菌剂分属多个化学结构类型，作用机理多样[13]，但浸苗技术并无区别，所有药剂均沿用浸苗3～10 min 的方法防治甘薯黑斑病[1,14]。

张岳等发现，醋酸苯汞和二氯萘醌在一定范围内对甘薯黑斑病的防治效果随药液浓度的增加而增加，随药剂处理时间的增加而降低，但易对薯苗造成药害[15]；方树民等发现，多菌灵和甲基硫菌灵的浸苗时间会影响其对甘薯蔓割病的防治效果[16]。可见，不同类型药剂所需的浸苗条件有所不同。防治其他病虫害的施药技术研究也表明，药剂作用机理、施药方式、施药剂量、药液用量等因素以及与作物间的相互作用均对防治效果有显著影响[17-19]。目前尚不确定影响浸苗防治甘薯黑斑病效果的关键因素，未见多因素协同作用影响浸苗效果的研究，无法判断不同类型药剂是否需要配套相应的浸苗技术。

为此，本研究选择内吸性的甲基硫菌灵(thiophanate-methyl) 和非内吸性的百菌清(chlorothalonil) 两种类型杀菌剂进行试验，明确浸苗时间或药液浓度的单因素变化与防治效果的关系；用正交法分析药剂浸苗时间、药液浓度和孢子浓度对甘薯黑斑病发病的影响；比较浸苗时间和药液浓度对两种药剂防治效果的影响，旨在为提高浸苗防治甘薯黑斑病的效果及农药使用的“减量增效”提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 供试菌株及分生孢子悬浮液制备 甘薯长喙壳菌Ceratocystis fimbriata 菌株由河南省农业科学院植物保护研究所分离，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (CGMCC)，菌株编号CFSC-01。将菌株在PSA 平板上25 ℃避光培养10 d，用无菌水洗下分生孢子，根据试验要求调节至合适的孢子浓度，制得孢子悬浮液，备用。

1.1.2 薯苗品种 商薯19 脱毒种薯由河南省农业科学院植物保护研究所提供。试验开始前将长度15 cm 左右的薯苗从种薯上剪下，去除全部叶片仅保留顶芽和腋芽，保湿备用。

1.1.3 供试药剂 36% 甲基硫菌灵悬浮剂( thiophanate-methyl 36% SC)，江苏蓝丰生物化工股份有限公司生产；40%百菌清悬浮剂 ( chlorothalonil 40% SC)，江阴苏利化学股份有限公司生产。

1.1.4 盆栽基质 将市售蛭石和草炭按照等体积混合，备用。

1.2 仪器设备

JJ-CJ-1G 洁净工作台，吴江市净化设备总厂；GZ-280BE-LED 光照培养箱，南京金恒实验仪器厂；FYL-YS-100L 恒温箱，北京福意电器有限公司；MLS-3750 高压灭菌锅，日本三洋电机株式会社；DHG-9146A 型电热恒温鼓风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司；Axio Scope.A1 型正置显微镜，德国Carl Zeiss 公司。

1.3 试验方法

1.3.1 药剂浸苗时间对防治效果的影响 根据预备试验结果，设置甲基硫菌灵和百菌清浸苗的质量浓度均为500 mg/L，浸苗时间分别为：1、5、10、30 min 和1、3、6、9、12 h，分别进行水培和盆栽试验，同时设置空白对照处理。每处理4 次重复，每重复10 株薯苗。

浸苗方法：在玻璃广口瓶中进行。药液深度4 cm 左右，将各重复薯苗单独浸苗，达到药剂处理时间后，将薯苗上药液沥干。

水培方法：将薯苗按重复转移至单独放置的孢子悬浮液 (孢子浓度为5 × 105孢子/mL) 中接菌6 h，孢子悬浮液深度4 cm 左右。接种后按重复转入装有无菌水的广口玻璃瓶中，放入光照培养箱中于25 ℃、光暗比16 h : 8 h 条件下培养。

盆栽方法：将700 cm3盆栽基质加入70 mL无菌水润湿后，加入100 mL 孢子悬浮液 (孢子浓度为1 × 106孢子/mL)，混匀，置于底部有孔的营养钵中，将薯苗插入。

分别于水培试验7 d 后、盆栽试验9 d 后调查黑斑病发病情况，计算防治效果。

1.3.2 药液浓度对防治效果的影响 根据药剂浸苗时间与防治效果的关系，设置甲基硫菌灵和百菌清浸苗时间均为6 h，甲基硫菌灵和百菌清浸苗的质量浓度分别为300、400、500、600 和700 mg/L，同时设置清水对照。每处理4 次重复，每重复10 株薯苗。浸苗方法、培养条件及培养时间同1.3.1节，取样调查黑斑病发病情况并计算防治效果。

1.3.3 药剂浸苗时间、药液浓度和孢子浓度对薯苗发病影响的正交试验 根据甲基硫菌灵和百菌清浸苗时间、药液浓度的单因素试验结果，设计正交试验，测定薯苗发病与药剂浸苗时间、药液浓度和孢子浓度3 因子的关系。每个因子设3 个水平，试验设计见表1。盆栽接种及薯苗培养条件同1.3.1 节的盆栽方法 (下同)。

表1 正交试验设计方案L9 (34)Table1 Scheme of orthogonal experiment L9 (34)

1.3.4 药剂浸苗时间与药液浓度的不同组合对防治效果的影响 根据单因素试验及正交试验结果，接种方法及薯苗培养方法参照1.3.1 节盆栽方法。甲基硫菌灵和百菌清的浸苗时间、药液浓度两因素均设4 水平，共16 个组合处理，每处理4 次重复，试验设计见表2 及表3。均设空白对照处理。

表2 甲基硫菌灵浸苗时间与药液浓度处理组合Table2 Dipping time and concentration of treatment combination with thiophanate-methyl

1.3.5 病圃验证试验 选择排种人工接种病薯的苗床为病圃，试验前清除所有病薯薯块，整地起垄进行试验。甲基硫菌灵和百菌清的质量浓度均为500 mg/L，浸苗时间分别为10 min、2 h 及6 h，同时设不浸苗的空白对照处理。每处理3 次重复，每重复扦插100 株健康薯苗，小区随机区组排列。

浸苗方法：在整理箱 (70 cm × 45 cm) 中配制药液，每处理单独配制，药液深度4 cm。将3 次重复的薯苗同时放入整理箱进行药剂处理，固定薯苗保持竖直向上，浸苗完成后晾干种入病圃，于定植21 d 后调查发病情况及单株鲜重。

1.3.6 防治效果计算方法及数据分析 水培试验中，甘薯病苗分级标准[20]为：0 级，无病斑；1 级，有零星小病斑出现，病斑总数＜5 个；3 级，病斑较大，病斑总数＜15 个；5 级，病斑相连，连片长度≤1.5 cm；7 级，病斑相连，连片长度＞1.5 cm。

盆栽试验中，甘薯病苗分级标准[21]为：0 级，无病斑；1 级，有一个长轴小于等于1 cm 的病斑；3 级，有两个长轴小于等于1 cm 的病斑或一个长轴大于1 cm 小于等于2 cm 的病斑；5 级，单独病斑或融合病斑长轴大于2 cm 小于等于3 cm，或短轴宽度达到茎粗一半；7 级，单独病斑或融合病斑长轴大于3 cm，或短轴达到茎粗的三分之二，植株生长不良。病情指数 (%) = ∑(各级发病薯苗数 × 相对级数值)/(调查总薯苗数 × 7) × 100；防治效果 (%) = (无菌水对照病情指数-药剂处理病情指数)/无菌水对照病情指数 × 100。

病圃验证试验调查各重复病株数量，不对病株进行分级。病株率 (%) = (病株数/调查总株数) ×100；防治效果 (%) = (空白对照区病株率-处理区病株率)/空白对照区病株率 × 100。

试验数据以平均值和标准差形式表示。应用DPS 8.01 专业版完全随机统计模块、非线性回归模块和正交试验统计模块进行分析，多重比较采用新复极差法进行[22]。

2 结果与分析

2.1 药剂浸苗时间对防治效果的影响

水培接种试验中，两种药剂的防治效果均随浸苗时间的增加而提高，但当甲基硫菌灵浸苗时间达到6 h 后或百菌清浸苗时间达到3 h 后，浸苗时间增加对防治效果影响不再显著。当浸苗时间为1 min 时，两种药剂的防治效果差别最大，之后随浸苗时间的增加而逐渐减小。

盆栽接种试验结果的变化规律与水培试验类似，只是到达峰值的时间不同，即两种药剂的防治效果同样随浸苗时间的增加而提高，但当甲基硫菌灵浸苗时间达到6 h 后或百菌清浸苗时间达到1 h 后，浸苗时间增加对防治效果影响不再显著。当浸苗时间为10 min 时，两种药剂的防治效果差距最大，1 min 处理次之。

由图1 可知，两种不同作用类型药剂甲基硫菌灵浸苗时间少于6 h、百菌清浸苗少于3 h 时，浸苗时间与防治效果呈正相关。在浸苗时间小于3 h时，百菌清防效高于相同浓度的甲基硫菌灵。水培和盆栽两组试验中防治效果随浸苗时间的变化趋势较一致。

2.2 药液浓度对防治效果的影响

水培接种试验中，两种药剂的防治效果随药液质量浓度的增加而提高。当药液质量浓度达到500 mg/L 时，再增加药液浓度甲基硫菌灵对防治效果影响不再明显；百菌清除500 mg/L 和600 mg/L两处理防治效果差异不显著外，其余各浓度处理间差异显著。两种药剂在300 mg/L 时防治效果差距最大。

盆栽接种试验的结果与水培试验结果一致，差别仅在于甲基硫菌灵的质量浓度达到600 mg/L时防治效果不再随药液质量浓度的增加而表现出显著差异。

由图2 可知，当甲基硫菌灵的质量浓度小于600 mg/L、百菌清小于700 mg/L 时，防治效果与药液质量浓度呈正相关。相同药液浓度下，浓度越低，两种药剂防治效果的差距越大。水培和盆栽两组试验中防治效果随药液浓度的变化趋势较一致。

2.3 药剂浸苗时间、药液浓度和孢子浓度对薯苗发病的影响

以病情指数为考察指标，由表4 可知，RC＞RB＞RA，表明防治药剂为甲基硫菌灵时，对薯苗发病影响由大到小的顺序为孢子浓度＞浸苗时间＞药液浓度。

由表5 可知，RC＞RA＞RB，表明以百菌清为防治药剂时，对薯苗发病影响由大到小为孢子浓度＞药液浓度＞浸苗时间。

由方差分析结果 (表4 和表5) 可知，两种药剂处理中，药液浓度、浸苗时间和孢子浓度3 个因素对甘薯黑斑病发病的影响都达到极显著水平，均为影响薯苗发病的关键因素。

2.4 药液浓度与浸苗时间不同组合对防治效果的影响

由图3 可知，甲基硫菌灵和百菌清两种不同类型药剂，在相同浓度下处理，防治效果均随浸苗时间的延长而增加；相同浸苗时间处理，防治效果均随药液浓度的提高而增加。其中，甲基硫菌灵浸苗360 min 且质量浓度为700 mg/L 的处理防治效果最好，达到72.5%；百菌清浸苗180 min且质量浓度为600 mg/L 的处理防治效果最好，达到85.1%。

表4 甲基硫菌灵正交试验结果Table4 Orthogonal experiment outcome using thiophanate-methyl

在浸苗处理30、120、240 和360 min 时，甲基硫菌灵700 mg/L 处理和400 mg/L 防治效果分别相差11.6%、18.8%、21.7%和26.8%，随浸苗时间延长而增加。在质量浓度为400、500、600和700 mg/L 时，浸苗360 min 和30 min 防治效果间分别相差27.5%、31.2%、39.8%和42.8%，随药液质量浓度的提高而增加。表明甲基硫菌灵需要充足的浸苗时间以保证药效发挥。

在浸苗处理10、30、60 和180 min时，百菌清600 mg/L 处理和300 mg/L 防治效果分别相差37.1%、33.8%、38.1%和33.3%，未随浸苗时间延长而明显增加。在300、400、500 和600 mg/L时，浸苗180 min 和10 min 防治效果间分别相差17.7%、18.3%、17.5%和13.9%，未随药液浓度提高而增加。同低浓度处理相比，浸苗时间的延长并不能更大程度提高百菌清高浓度处理的防治效果，与甲基硫菌灵不同。

以防治效果 (y) 为因变量，药液浓度 (x1) 和浸苗时间 (x2) 为自变量，可根据上述试验结果构建二元回归方程，甲基硫菌灵为y = -12.618 4 + 0.067 6 x1+ 0.106 9x2(x1区间400～700 mg/L，x2区间30～360 min)，百菌清为y = 0.100 5 + 0.119 9x1+0.084 0x2(x1区间300～600 mg/L，x2区间10～180 min)。方差分析结果F 值分别为84.31、83.36，F ＞F0.01(2,13)，故两方程y 与x1、x2之间有真实二元线性回归关系；tx1、tx2分别大于t0.01，表明两方程x1、x2对y 的偏回归极显著。根据两回归方程中x1和x2的系数可以判断，在设定范围内提高药液浓度或延长浸苗时间均可提高两药剂的防治效果(表6)。

2.5 病圃验证试验结果

由表7 数据可知，甲基硫菌灵、百菌清分别以质量浓度500 mg/L 浸苗6 h，病株率分别为13.3%和12%，防治效果达分别为83.6%和85.2%，单株平均鲜重分别为60.1 g 和58.7 g，均显著高于其他处理。当浸苗时间为2 h 时，甲基硫菌灵和百菌清的防治效果分别为4.1%和70.9%，两者防治效果差异显著。当浸苗时间为10 min 时，两者的防治效果分别为 -1.6%和24.2%，其单株平均鲜重与空白对照处理差异不显著。表明药剂浸苗时间显著影响防治效果，而药剂防治效果显著影响薯苗生长 (鲜重)，相对于百菌清，甲基硫菌灵需要更长的浸苗时间。

表6 回归方程的显著性检验及回归分析Table6 Significance test and regression analysis of regression equation

表7 不同浸苗时间对甘薯黑斑病田间防治效果及对甘薯鲜重的影响Table7 Effect of different dipping time on the control efficiency of black rot and fresh weight of sweet potato

3 结论与讨论

甘薯的种植模式为种薯育苗，剪苗栽插[23]。通过近距离接触、混合屯苗、可使病苗侵染健苗，栽插后的灌溉水和粪肥带菌也可造成薯苗感病，薯苗感染黑斑病后生长受抑制，后期会形成病薯[1]。减少或杜绝病苗产生是防治甘薯黑斑病的必要环节，杀菌剂浸苗是重要的防治手段[1]。

施药技术与药剂的作用效果密切相关，通过改变施药方式[24-25]、选择合适剂型等[26]可以提高药剂的防治效果。而针对特定的施药方式和药剂特性优化施药条件，同样是达到农药“减量增效”的重要手段。以喷雾施药为例，通过优化雾滴粒径和密度、降低施药液量等，在不改变用药量的情况下，可以有效提高农药利用率和防治效果[27-29]。病圃试验结果显示，甲基硫菌灵和百菌清按500 mg/L 剂处理薯苗，常规浸苗10 min 时，防治效果分别为 -1.6%和24.2%，远未达到防治预期。

本试验采用病原菌分生孢子悬浮液混入盆栽基质的方法模拟外部病原菌侵染薯苗[21]，做到了发病均匀，病情可控，规避了其他苗病干扰等因素。通过试验发现，在浸苗防治甘薯黑斑病时，百菌清、甲基硫菌灵浸苗时间与防治效果呈正比，浸苗时间分别达到3 h、6 h 时防治效果最佳。此结果与甲基硫菌灵浸苗防治甘薯蔓割病时60 min内防治效果与浸苗时间呈正比的结果一致[16]，与目前生产上普遍沿用的浸苗时间差异明显。正交试验进一步明确了浸苗时间、药液浓度和孢子浓度对薯苗发病的影响均达到极显著水平，均是影响防治效果的关键因素。在此基础上可进一步研究不同侵染途径病原菌的检测，评估薯苗的感病风险，有针对性地调整浸苗条件。

根据药剂浸苗时间和药液浓度的不同组合试验结果及构建的回归方程表明，在一定范围内，提高药液浓度和延长浸苗时间均可以提高防治效果，但甲基硫菌灵和百菌清防治效果随施药条件变化的趋势明显不同。此现象与两种类型药剂丙环唑和嘧菌酯 (≤0.05 g/L) 随浓度和雾滴密度变化对小麦白粉病菌的抑制率差异有相似之处[30]。内吸性的甲基硫菌灵需要充足的浸苗时间从而达到理想防治效果；非内吸性的百菌清不同药液浓度间的防治效果差异大于不同浸苗时间间的防治效果差异。病圃试验同样验证了这两种药剂在不同浸苗时间下的防治效果显著不同。为保证防治效果，使用甲基硫菌灵浸苗时，浸苗时间应达到6 h，如果想提高浸苗效率，可选择适当提高百菌清浓度并减少浸苗时间。本试验为了避免不同剂型干扰试验结果，两种药剂均选用悬浮剂，但在相同浸苗条件下剂型对防治甘薯黑斑病是否有影响还不明确，有待进一步研究。

总之，杀菌剂浸苗防治甘薯薯苗黑斑病，浸苗时间、药液浓度、孢子浓度均为影响防治效果的关键因素，各因素对发病的影响随药剂类型的不同而变化。在一定范围内，可通过提高药液浓度和延长浸苗时间达到提高防治效果的目的。甲基硫菌灵和百菌清的防治效果随药液浓度和浸苗时间变化的趋势不同，甲基硫菌灵对浸苗时间的要求显著高于百菌清。不同类型药剂需配套相应的浸苗技术才能保证药效发挥。