磁性分散固相萃取-QuEChERS 结合气相色谱-串联质谱法检测不同柑橘基质中多种农药残留

杨 秦, 张耀海, 周 杰, 焦必宁

(1. 中国农业科学院/西南大学 柑桔研究所，农业农村部柑桔产品质量安全风险评估实验室(重庆)，重庆 400712；2. 农业农村部柑桔及苗木质量监督检验测试中心，重庆 400712)

农药在柑橘生产过程中起着不可替代的作用，然而，不规范使用农药导致柑橘中农药残留超标问题时有发生，影响环境安全、出口贸易以及消费者健康[1]。

目标农药的提取、分离、净化和浓缩等前处理技术是整个分析过程中的关键[2]。与传统的QuEChERS 净化剂相比，经磁性纳米粒子 (MNPS)共聚结合的净化剂比表面积大、扩散距离短，只需少量MNPS 吸附和较短平衡时间就能实现萃取分离，因此磁性分散固相萃取 (MDSPE) 具有更高的萃取能力和萃取效率[3]。将MDSPE 与QuEChERS相结合，能在更少的时间内完成目标物分析，并且能够更好地减少样品中的基质干扰。

关于柑橘中农药多残留检测方法主要包括液相色谱法 (LC-MS)[4-5]、气相色谱法 (GC-MS)[6-8]、气相色谱-串联质谱 (GC-MS/MS)[9-10]和液相色谱-串联质谱法 (LC-MS/MS)[11-13]等，但鲜有利用基于Fe3O4-GCB-PSA-无水MgSO4共聚物的MDSPEQuEChERS 结合GC-MS/MS 分析不同柑橘基质中多种农药残留的报道，也未见不同农药在不同柑橘品种中基质效应的系统研究。鉴于此，本研究采用Fe3O4-GCB-PSA-无水MgSO4共混物作为前处理净化剂，结合GC-MS/MS，快速分析检测了5 种代表性柑橘基质 (宽皮柑橘、甜橙、柚子、柠檬和金桔) 中的75 种农药残留，分析了不同农药在不同柑橘品种中的基质效应，旨在更好地分析确证不同柑橘基质中的多种农药残留。

1 材料与方法

1.1 材料、药剂与试剂

5 种柑橘：宽皮柑橘 (C. reticulata)(兴津温州蜜柑)，甜橙 (C. sinensis)(纽荷尔脐橙)，金桔 (C.fortunella)(滑皮金柑)，柠檬 (C. limion)(尤力克柠檬)，柚子 (C. grandis)(东风早)

药剂与试剂：75 种农药标准品见表1。乙腈(色谱纯，美国Merck. Sigma-Aldrich 公司)；丙酮(色谱纯，成都科隆化学有限公司)；无水硫酸镁[分析纯，重庆川东化工 (集团) 有限公司]；氯化钠 (分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；N-丙基乙二胺 (PSA) 和石墨化碳黑 (GCB)(德国CNW Technologies GmbH 公司)；纳米级四氧化三铁(20 nm，球形，纯度 ≥ 99.5%)(长沙晶康新材料科技有限公司)。

1.2 仪器与设备

岛津GC-2030 和岛津GC-MS TQ8040 NX(日本岛津公司)；CL31/CL31R 多用途离心机 (美国Thermo Fisher 公司)；CK2000 型高通量组织研磨仪 (美国Thmorgan 生物科技有限公司)；WD-12 型水浴氮吹仪 (杭州奥盛仪器有限公司)。

1.3 分析方法

1.3.1 仪器检测条件

色谱条件：色谱柱为SH-Rxi-5Sil MS 石英毛细管柱 (30 m × 0.25 mm，0.25 μm)；升温程序为60 ℃保持1 min，然后以40 ℃/min 升至180 ℃，再以8 ℃/min 升至280 ℃，保持8 min；平衡时间1 min；载气为氦气，流速1 mL/min，恒流模式；进样口温度 250 ℃；进样量1 μL；不分流进样。

质谱条件：电子电离源 (EI)，电子能量70 eV；离子源温度200 ℃；传输线温度280 ℃；溶剂延迟时间为3 min；多反应监测 (MRM) 模式。

1.3.2 标准溶液配制 分别称取75 种农药标准品，用丙酮溶解，配制成质量浓度为1 000 mg/L的标准储备液，置于棕色试剂瓶中，于-18℃保存。分别移取适量的标准储备液，以丙酮稀释，配制成质量浓度为100 mg/L 的混合标准储备液，于-18℃保存。待测定时根据需求以丙酮逐级稀释成混合标准工作溶液，现配现用。

1.3.3 样品制备 样品的采集参考《农药残留分析样本的采样方法》[14]。用干净纱布轻轻拭去柑橘样品表面杂质，采用对角线分割法将全果等分为4 份，取对角部分切碎，匀浆，备用。

表1 75 种农药标准品纯度、保留时间及GC-MS/MS 的质谱条件Table1 Retention time of 75 pesticides and mass spectrometry conditions of GC-MS/MS

续表 1Table1 (Continued)

1.3.4 样品前处理 称取5 g (精确至± 0.01 g) 样品，加入5 mL 乙腈，于1 000 r/min 下振荡10 min，置于 -18 ℃冰箱静置15 min (防止后续加入无水硫酸镁和氯化钠后过热，影响热不稳定性农药的回收率[15])；加入2.0 g 无水硫酸镁和0.5 g 氯化钠，以1 000 r/min振荡5 min，于10 000 r/min下离心5 min；取上清液1.5 mL，加入预先装有30 mg MNPS、20 mg PSA、30 mg GCB 和100 mg 无水硫酸镁的5 mL离心管中，涡旋1 min，使用磁铁将净化剂吸附于离心管壁，30 s 后吸取1 mL 上清液，于45 ℃水浴氮吹至近干，再用1 mL 丙酮复溶，涡旋混匀后过0.22 μm 滤膜，待GC-MS/MS 检测分析。

2 结果与分析

2.1 定性和定量离子的选择

通过全扫描 (Q3 Scan) 模式得到每种农药的保留时间；选择离子信号强的特征离子作为母离子，进行产物离子扫描，将目标农药的母离子打碎，选择响应值高的2 个或3 个离子作为子离子；选择MRM 模式，碰撞能量范围设置为2～40 eV，最终得到最佳碰撞能量。GC-MS/MS 系统可根据Smart 技术自动划分时间段，不需要使用色谱分段法划分时间段。图1 为75 种农药的总离子流图，优化后的GC-MS/MS 的质谱条件见表1。

2.2 样品前处理优化

2.2.1 GCB 用量的优化 GCB 对基质中的色素有很强的吸附能力，但其也容易吸附具有平面结构的农药[16-17](如百菌清、敌敌畏、嘧霉胺等)。因此，本研究在75 种农药中选择14 种具有平面结构的代表性农药，通过其回收率确定GCB 的最佳用量。

以温州蜜柑为例，称取5 g (精确至0.01 g) 样品，固定无水MgSO4用量为100 mg，分别取GCB 用量为0、10、20、30、40 和50 mg，每处理重复3 次。向温州蜜柑空白基质标准溶液中添加0.1 mg/kg的14 种农药混合标准溶液。由图2可以看出，敌敌畏、2,4,6-三氯苯酚、嘧霉胺、百菌清和烯唑醇5 种平面性较强的农药的回收率随着GCB 用量的增加而降低，其他9 种农药受GCB 用量的影响不大；且当GCB 用量达到30 mg之后基质颜色变化不大，呈无色透明。因此，选择GCB 的用量为30 mg。

2.2.2 PSA 用量的优化 PSA 具有两个胺基，是一种强阴离子交换剂，能够去除基质中的脂肪酸、酚酸、糖等酸性物质和部分极性色素，防止杂质聚积在进样口、衬管和柱头而产生基质效应[18-19]。因此，本研究探究了PSA 的添加量对农药回收率的影响。

仍以温州蜜柑为例，分别取PSA 用量为0、20、30、40 和50 mg，其他条件同2.2.1 节。由图3可以看出，随着PSA 用量的增加，农药的回收率先升高后降低，其原因可能是因为PSA 含有胺基，会与酸性农药发生反应，使得农药响应值降低。当PSA 用量为20 mg 时，大部分农药的回收率在70%～120%之间，符合《农作物中农药残留试验准则》[20]要求。因此，选择PSA 的用量为20 mg。

2.2.3 MNPS 用量的优化 本研究使用的MNPS 为20 nm 的Fe3O4，基于“物理共混”的方式[21]，MNPS与GCB、PSA 和无水MgSO4混合后，MNPS 被包裹到GCB、PSA 和无水MgSO4聚集形成的聚集团中，形成具有磁性的共混物[22-23]。待该共混物加入基质中涡旋1 min 后，外加磁场将共混物吸附在管壁便可吸取上清液，但必须有足够的MNPS与GCB、PSA 和无水MgSO4形成共混物，才能够确保GCB、PSA 和无水MgSO4能够从基质中完全分离[7,24]。因此，本研究探究了MNPS 的最佳用量。

仍以温州蜜柑为例，固定GCB、PSA 和无水MgSO4的用量分别为30 mg、20 mg 和100 mg，MNPS 的用量分别为0、20、30、40 和50 mg，每处理重复3 次。其他条件同2.2.1 节。由图4 可知，随着MNPS 用量增加，大部分农药的回收率呈先升高后降低的趋势，并于20 mg 时达到峰值，但据观察20 mg 的MNPS 不能使GCB、PSA和无水MgSO4完全从基质中分离出来。因此，选择MNPS 用量为30 mg。

2.3 MNPS 对净化效果的影响

考察了添加MNPS 与否对净化效果的影响。由图5 可见，添加MNPS 后杂质峰响应值降低，而且杂质峰更少，该结果与Zheng 等[25]、LI 等[22]的结果相似，可见加入MNPS 对去除杂质具有积极的影响。

2.4 基质效应

柑橘种类繁多，鲜食品种主要为宽皮柑橘、甜橙、柚子、柠檬和金桔等，不同柑橘品种的基质具有显著差异，基质效应的存在会增大测量误差，影响方法灵敏度和准确度，最终影响农药定性和定量结果[26-28]。

用丙酮分别配制0.01、0.02、0.05、0.1、0.2 和0.5 mg/L 的农药混合标准溶液，并用5 种空白基质配制相同浓度的基质匹配混合标准溶液，以基质匹配标准曲线斜率/溶剂标准曲线斜率计算基质效应 (Me)，Me小于1 属于基质增强效应，大于1 属于基质抑制效应[29]，结果见表2。由表2 可见，与溶剂标准溶液相比，75 种农药残留的响应值普遍显著增强，这与柑橘复杂基质和仪器类型均有关。除柠檬与温州蜜柑中的三氯杀螨醇和甲基谷硫磷，柠檬中的抗蚜威、硫环磷和联苯肼酯以及甜橙中的异狄氏剂醛表现出较强的基质抑制效应外，其余基质中除目标化合物以外的其他成分在GC-MS/MS 上对目标化合物的响应值均具有增强效应，这可能是因为非目标化合物影响了待测化合物的气化或者离子碎片化的效率[30]，以及部分化合物由于进样口温度过高易被分解，如异狄氏剂醛。5 种柑橘基质中，柠檬和金桔的基质效应普遍较高，这可能与柠檬和金桔的含水量低、黏度大、油胞较多和更为复杂的基质环境等有关，如金桔富含更独特的营养功能成分[30]；75 种农药中，久效磷 (14.9～28.55)、乐果 (12.09～16.26)、螺螨酯 (7.75～10.86) 和δ-六六六 (9.71～9.99) 的基质效应较高。因此，建议在检测柠檬和金桔中的农药残留时，最好使用基质匹配标准溶液进行定

量分析。此外，该方法与QuEChERS 法[31]相比部分农药的基质效应有所减弱。

表2 五种柑橘基质的基质效应、检出限和定量限Table2 Matrix effects, LOD and LOQ of the five citrus matrices

续表 2Table2 (Continued)

2.5 方法评价

根据《农作物中农药残留试验准则》[20]进行方法评价。向5 种柑橘基质空白样品中添加75 种农药标准品，大部分农药的添加水平分别为0.01、0.05 和0.1 mg/kg，每个水平重复6 次，而敌敌畏在温州蜜柑和金柑中，久效磷在温州蜜柑、甜橙和金柑中，硫线磷在5 种柑橘中，硫环磷在柠檬中，炔螨特在温州蜜柑、甜橙和金柑中，甲基谷硫磷在甜橙、柚子和金柑中的添加水平分别为0.02、0.05 和0.1 mg/kg，添加回收率测定结果如附加材料表1 所示。宽皮柑橘中平均回收率为65%～113%，RSD 为0.50%～14%；甜橙中平均回收率为60%～115%，RSD 为0.40%～14%；柠檬中平均回收率为6 3%～1 1 8%，R S D 为1.0%～16%；柚子中平均回收率为63%～106%，RSD为0.30%～13%；金桔中平均回收率为61%～117%，RSD 为0.30%～14%；均满足农药多残留检测要求。与其他4 种柑橘基质相比，金桔中的部分化合物回收率较低，这与金桔的含水量低、黏度大、样品分散性小有关。

标准曲线线性范围为0.01～0.5 mg/L，决定系数均大于0.99。检出限 (LOD) 为3 倍信噪比时的浓度，定量限 (LOQ) 为10 倍信噪比时的浓度[32-33]。据此得出方法的LOD 为1～7 μg/kg，LOQ 为10～20 μg/kg；75 种农药中，除敌敌畏、久效磷、硫线磷、硫环磷、甲基谷硫磷和炔螨特的LOD 和LOQ 较高外，其他农药的LOD 均小于4 μg/kg，LOQ 均为10 μg/kg，证明该方法灵敏度较好。

2.6 实际样品检测

为了验证该方法的实际应用能力，抽取柑橘主产地95 个样品，采用所建立的方法进行检测。结果显示，其中75 个样品有农药残留检出，累计检出18 种农药，其中毒死蜱、丙溴磷、戊唑醇、苯硫威、氯氰菊酯、炔螨特、螺螨酯、哒螨灵、联苯肼酯、氯氟氰菊酯及腈菌唑等11 种农药检出率较高，大于5%，这与实际生产调研结果[34-35]相符；一个脐橙样品中，三唑磷和联苯菊酯的残留量均大于GB 2763—2019[36]中规定的最大残留限量值 (分别为0.2 和0.05 mg/kg)。结果表明，本方法简单、快速、准确、灵敏度高、重现性良好，与现有的文献报道[33-34,37]和国家标准相比，无需第2 次离心，检测成本较低 (约5 元/样品)，同时可避免使用大量有机溶剂，减少了对环境的污染，因此可作为大批量多种柑橘鲜果样品中多种农药残留的筛选和确证方法。

3 结论

本研究通过优化磁性分散固相萃取-QuEChERS前处理技术，结合气相色谱-串联质谱建立了快速检测5 种柑橘基质中75 种农药残留的方法。该方法操作简便快捷，能在较短时间内完成75 种农药的残留分析，具有准确度、精确度和灵敏度好等优点，适用于大批量不同品种柑橘中农药的多残留检测。研究表明，5 种柑橘基质中，柠檬和金桔的基质效应普遍较高，因此建议应采用基质匹配标准溶液进行定量。