纤维素酶CtCel8A的异源表达及其降解黄原胶性能

姜 海 珠， 周 海 龙， 谷 金 芸， 李 宪 臻， 杨 帆

( 1.大连工业大学 生物工程学院， 辽宁 大连 116034； 2.中国生物发酵产业协会, 北京 100833 )

0 引 言

现已报道的黄原胶降解方法有物理降解法[2](辐照法、超声波等)、化学降解法[3-4](氧化剂、酸、碱等)和生物降解法[5](酶解)。其中，物理降解法常伴有交联降解反应，且自动化设备处理能力受限，难以实现工业化生产[6]；化学降解法选择性差，易产生副产物[7]；而酶法降解反应条件温和，选择性好，是降解黄原胶主链的理想方法[8]。目前，酶法降解黄原胶的报道不多，且主要采用商品化纤维素酶对黄原胶的类纤维素主链进行降解，但效果均不理想[9]。

来自热纤梭菌(Clostridiumthermocellum)的纤维素内切酶CtCel8A相对于其他来源的纤维素酶具有酶活力高、耐高温的优点[10]。因此，该酶被广泛用于酶工程研究，目的是实现纤维素到燃料乙醇的生物转化[11]。本实验对内切酶CtCel8A的编码基因进行克隆，利用大肠杆菌的高表达系统进行纯化及酶学性质表征，并考察该酶切割黄原胶主链的性能，以期为黄原胶寡糖的工业化生产提供有效、可靠地生产方法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

EscherichiacoliDH5α，宝日医生物技术有限公司；质粒pET-28a (+)和E.coliBL21 (DE3)，获赠于大连化物所赵宗保研究员课题组。

限制性酶BamH Ⅰ和Hind Ⅲ、250 bp DNA Marker、PrimeSTAR HS DNA聚合酶，宝生物工程(大连)有限公司。

LB液体培养基：胰蛋白胨10.0 g/L，氯化钠10.0 g/L，酵母浸粉5.0 g/L；LB固体培养基：琼脂粉15.0 g/L，其余同LB液体培养基[12]。当进行质粒菌培养时，培养基添加终质量浓度为30 μg/mL 的卡那霉素。

梯度PCR仪，艾本德股份公司；DYY-11型电泳仪，北京六一科技有限公司；ImageQuant成像分析系统，美国通用电气公司；AKTA蛋白纯化仪，美国通用电气公司；JY92-IIN超声破碎仪，宁波新芝生物科技有限公司；UV5200紫外光度计，上海元析仪器有限公司；1260凝胶色谱仪，安捷伦科技有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 引物设计

纤维素内切酶CtCel8A编码基因Ctcel8的克隆及表达载体构建、鉴定所用引物均合成于宝生物有限公司。引物序列及功能如表1所示。

表1 引物序列及功能Tab.1 Sequences and functions of primers

1.2.2 纤维素内切酶编码基因Ctcel8的全基因合成

纤维素内切酶CtCel8A的核苷酸序列全长为1 137 bp，由上海生工有限公司进行全基因合成，合成的片段被亚克隆至通用载体pUC57，构成pUC57-Ctcel8。

1.2.3 pET-Ctcel8表达载体的构建

为了获得带有目的基因Ctcel8的表达载体，首先以上海生工有限公司合成的pUC57-Ctcel8为模板，引入带有BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位点的上游引物Cel-F和下游引物Cel-R进行编码基因扩增。PCR反应体系：pUC57-Ctcel8 100 ng，dNTPs 5.0 mmol/L，引物40 μmol/L，5×Primer STAR buffer 20 μL，Prime STAR聚合酶2.5 U，加无菌水至100 μL。PCR反应条件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1.2 min，30个循环，72 ℃ 5 min[13]。扩增产物用凝胶电泳进行检测，使用胶回收试剂盒进行基因片段回收。将回收的PCR产物和pET-28a质粒用限制性酶BamH Ⅰ和Hind Ⅲ进行双酶切，回收的酶切片段与质粒(浓度比为1∶3)在16 ℃孵育2.5 h进行连接。连接产物转化至E.coliDH5α感受态细胞中，涂于含有卡那霉素的LB平板上，筛选阳性克隆并测序验证。

1.2.4 纤维素内切酶CtCel8A的表达与纯化

将表达质粒pET-Ctcel8转化至BL21(DE3)感受态细胞中，随机挑取阳性单菌落进行PCR鉴定，正确的转化子进行蛋白质表达。

BL21(DE3)-Ctcel8种子液以1∶50的比例扩培于500 mL LB液体培养基(含卡那霉素)中，37 ℃、200 r/min振荡培养，OD600为0.6时加入终浓度1.0 mmol/L的IPTG；发酵液于16 ℃诱导18 h；9 000g离心3 min后收集菌体，30 mL Binding buffer重悬菌体后，超声波法裂解细胞。利用Ni-NTA琼脂糖树脂对带有6His纯化标签的纤维素内切酶CtCel8A进行亲和纯化，详细步骤参照相关文献[14]。所有蛋白质样品均用SDS-PAGE电泳进行分析，蛋白质浓度用Bradford法[15]进行测定。

1.2.5 纤维素内切酶CtCel8A的酶活测定

100 μL酶液与100 μL 0.1%黄原胶混匀，70 ℃ 反应20 min，冰浴15 min终止反应，在酶反应体系中加入等体积冰冷的聚氰基丙烯酸正丁酯BCA溶液，75 ℃反应30 min，在OD562处测量吸光度。阴性对照为沸水浴灭活的酶液[16]。

酶活力单位的定义：每分钟释放1 μmol葡萄糖所需酶的量为1 U。

1.2.6 纤维素内切酶CtCel8A的最适温度及温度稳定性测定

酶的最适温度实验是在20、30、40、50、60、70、80 ℃分别反应20 min后测定酶活力，以最高酶活力为100%，计算各温度下的相对酶活力。将酶液分别在20、30、40、50、60、70、80 ℃下连续孵育1 h后测定残余酶活力，以最高酶活力为100%，计算相对酶活力，绘制酶热稳定性曲线。

1.2.7 纤维素内切酶CtCel8A的最适pH及pH稳定性测定

酶的最适pH是将酶液分别用缓冲液调节pH至2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0，再于70 ℃与黄原胶反应20 min进行酶活力测定，以最高酶活力为100%，计算各pH下的相对酶活力。酶的pH稳定性测定实验是将酶液在不同pH的缓冲液中分别孵育2 h后，在pH 5.5、70 ℃条件下反应20 min，以最高酶活力为100%，计算相对酶活力。

1.2.8 纤维素内切酶CtCel8A降解黄原胶产物的凝胶渗透色谱分析

色谱柱采用三柱串联(PL aquagel-OH 60，PL aquagel-OH MIXED-M和PL aquagel-OH 30分离柱)。柱温设定为40 ℃，20 μL样品(1 g/L)由0.1 mol/L NaNO3稀释而成，体积流量0.8 mL/min。采用示差折光检测。采用普鲁兰糖作为分子质量标准品。用各组分的积分折射率(RI)峰面积除以18～33 min测得的总RI峰面积，计算相对分子质量分布[17]。

2 结果与讨论

2.1 纤维素内切酶编码基因Ctcel8的全基因合成及序列分析

将上海生工有限公司合成的pUC57-Ctcel8(带有密码子优化后的Ctcel8核苷酸序列)送宝生物公司测序，利用DNAStar软件中的MegAlign比对程序将测序结果与Genebank提交的Ctcel8核苷酸序列进行序列比对，如图1所示。结果表明，DNA序列长度为1 137 bp，共有156处密码子成功地按照大肠杆菌的密码子偏好性进行了优化，DNA序列的GC含量由优化前的45.21%变为50.92%。

2.2 纤维素内切酶CtCel8A表达载体及菌株的构建

以pUC57-Ctcel8为模板扩增纤维素内切酶的编码基因Ctcel8，凝胶电泳结果如图2所示。特异性条带在1 100 bp左右，与目的片段Ctcel8的理论大小相符。利用凝胶回收试剂盒回收扩增片段并送测序，测序结果与NCBI数据库比对证明为纤维素内切酶CtCel8A的编码基因，该基因编码的纤维素内切酶CtCel8A含有379个氨基酸残基，理论分子质量为41.8 ku，属于糖苷水解酶GH8家族[18]。为了构建基因Ctcel8的表达载体，将BamH Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切的基因片段Ctcel8及表达载体pET-28a于4 ℃过夜连接并转化至E.coliDH5α感受态细胞中。随机挑取阳性单克隆提取质粒并进行BamH Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切验证。验证结果如图3所示，1～4号重组质粒经双酶切后有两条特异性条带，大小为1 200 和5 300 bp，与预计的酶切结果一致。将酶切鉴定正确的质粒送至测序公司进行测序，测序结果表明，纤维素内切酶CtCel8A的表达载体pET-Ctcel8成功构建。将表达载体pET-Ctcel8转化至感受态细胞E.coliBL21(DE3)中，37 ℃静置培养12 h，挑取阳性克隆进行表达。

2.3 纤维素内切酶CtCel8A的异源表达及纯化

在CtCel8A的表达菌BL21-pET-Ctcel8中加入终浓度1.0 μmol/L IPTG于16 ℃诱导培养18 h。离心后收集菌体进行细胞破碎，获得CtCel8A的粗酶液。利用Ni-NTA亲和填料对CtCel8A进行蛋白质纯化。SDS-PAGE电泳结果如图4所示，CtCel8A能够成功地在大肠杆菌中高效可溶性表达。经过平衡、亲和吸附、洗涤、洗脱等步骤，获得纯度较高的CtCel8A条带。目的蛋白CtCel8A分子质量约为40 ku。

经Bradford法检测纯化的CtCel8A结果质量浓度为2.3 mg/mL，底物为黄原胶时，比酶活为98.3 U/g，目的蛋白质的回收率为69.2%，纯度大于95%，如表2所示。

2.4 纤维素内切酶CtCel8A水解黄原胶的性质

2.4.1 最适温度及热稳定性

如图5(a)所示，纤维素内切酶CtCel8A在反应温度为60～70 ℃时酶活力相对较高，在温度大于70 ℃时，酶活力急剧下降，该酶的最适酶促反应温度为70 ℃。由酶的热稳定性曲线(图5(b))可知，CtCel8A在20～70 ℃进行温育时，酶活力能够保持稳定，在高于70 ℃时，随着温度升高酶的稳定性迅速降低。

1，纯化后目的蛋白；M，蛋白marker图4 亲和纯化后CtCel8A的SDS-PAGE电泳图Fig.4 SDS-PAGE result of CtCel8A after affinity purification

表2 重组纤维素内切酶CtCel8A的纯化结果Tab.2 Purification profile of recombinant CtCel8A

图5 纤维素内切酶CtCel8A的最适温度及热稳定性

2.4.2 最适pH及pH稳定性

CtCel8A最适pH测定结果如图6(a)所示，在pH 5.5时酶活力达到最高值，随着pH逐渐变化(低于5.0或高于6.5)，酶活力急剧下降。当酶液在pH 5.0～8.5的缓冲液中温育2 h后，均能够保持稳定的酶活力，一旦缓冲液pH超过该范围，酶稳定性急剧下降(图6(b))。该结果说明CtCel8A对酸性或碱性环境的耐受能力较差。

图6 纤维素内切酶CtCel8A最适pH及pH稳定性

Fig.6 The optimum pH and pH stability of CtCel8A

2.4.3 黄原胶酶解产物的分子质量分布

利用凝胶渗透色谱对纤维素内切酶CtCel8A水解黄原胶产物的分子质量分布进行分析，结果如图7所示。黄原胶酶解产物为两种，一种为未降解的高分子质量黄原胶(保留时间18～21 min)，一种为降解后的中等分子质量黄原胶(保留时间21～24 min)。部分黄原胶未被降解的主要原因是，黄原胶高度致密有序的二级结构使得CtCel8A难以接近相应的酶切位点[19]。与之前相关研究结果相比，纤维素内切酶CtCel8A能够有效地将高分子质量、结构复杂的黄原胶水解为中等分子质量产物[20]。

图7 纤维素内切酶CtCel8A水解黄原胶的凝胶 渗透色谱Fig.7 Gel permeation chromatography elution patterns of xanthan after incubation with CtCel8A

3 结 论

对来自热纤梭菌的纤维素内切酶的编码基因Ctcel8进行了密码子优化和全基因合成，在大肠杆菌中对融合了His标签的Ctcel8进行异源表达，SDS-PAGE电泳分析表明该蛋白具有较高的可溶性表达水平，纯化回收率达69.2%。对纯化的CtCel8A进行酶学性质分析，结果表明该酶的最适作用温度为70 ℃，最适pH为5.5，对高温的耐受力较强，但该酶对酸性及碱性环境的耐受力较差。凝胶渗透色谱结果表明，CtCel8A能够有效地切割黄原胶主链，将其水解为中等分子质量产物。