MicroRNA在肺癌顺铂耐药机制的研究进展

白思特 韦忠恒

广西壮族自治区百色市右江区右江民族医学院附属医院,广西 百色 530000

非蛋白质编码微小RNA(microRNA,miRNA)是一类长度约20-25个碱基对构成的非编码小分子单链RNA，它通过与靶mRNA 的3’UTR特异结合，引起mRNA降解或者翻译抑制，调控基因表达[1]。到目前为止已经报道的人类miRNA的数量超过21,000,它调节超过60%的蛋白质编码基因的表达。目前已确定 miRNA在调控免疫系统、细胞增殖和分化、生长发育、肿瘤和细胞周期中有着重要作用。miRNA同时与恶性肿瘤密切相关，可以促进或者抑制肿瘤发生[2]。第一个被发现的miRNA(lin-4)存在于秀丽隐杆线虫中，它调控 lin-14基因的蛋白质表达[3];几年之后在线虫中发现第二个miRNA(let-7)[4]。这两个miRNA的发现促进了成为生命科学和医学研究的热点之一，目前miRNA已经成为人们阐明一些重要疾病的发生机制和进行疾病诊断与治疗的新切入点。

1 微小RNA在肿瘤中生物学功能

2002年Calin等[5]首次在慢性淋巴细胞白血病(CLL)中发现has-miR-15a和has-miR-16-1下降或缺失，特别是在试图识别染色体13q14上的肿瘤抑制基因时，该基因在CLL中经常缺失。这个关键区域并不包含编码肿瘤抑制基因的蛋白质，而是实际上包含了两个在同一多顺反子RNA中表达的miRNA基因：miR-15a、miR-16-1。这一结果首次证明了miRNA可能与人类癌症的发病机制有关，由此确立了miRNA与肿瘤的相关性。先前研究发现miRNA的特异性表达与肿瘤的发生和发展有关，其中一些miRNA呈现出促癌或抑癌作用[6]。比如miR-135a 抑制剂对miR-135a的阻滞使 MES-SA和A549紫杉醇耐药细胞系对紫杉醇诱导的细胞死亡敏感[7]。抑制miR-221或miR-222 表达使MDAMB-468细胞对他莫昔芬诱导的细胞生长停滞和凋亡敏感[8]。miR-451的过表达通过上调MDR1表达使乳腺癌细胞系MCF-7对阿霉素敏感[9]。miR-214的增加和let-7i的表达减少与卵巢癌细胞系中的顺铂耐药性有关[10-11]。这些研究也进一步证实了miRNA的新的作用，即miRNA不仅参与细胞增殖、分化、凋亡、周期调控，而且对化疗耐药也产生重要影响。Cao等[12]研究顺铂耐药的A549细胞的生存能力及miR-192-5P和Bcl-2的表达水平时发现，顺铂耐药的A549细胞中miR-192-5P的表达水平明显低于正常细胞，miR-192-5P主要作用于Bcl-2，进一步证实通过抑制miR-192-5P使Bcl-2蛋白表达量明显增高，导致细胞凋亡受阻，从而产生耐药性。秦学博等[13]PC9和PC9/AB11细胞株microRNA表达谱存在明显差异，初步筛选到了13个与肺腺癌吉非替尼耐药密切相关的miRNAs，为进一步深入研究miRNA在肺腺癌吉非替尼获得性耐药中的作用及其分子机制提供了实验依据和理论基础。并由以上的研究发现miRNA与肿瘤的具有一定的相关性。这些研究也从一方面证实miRNA不断影响着我们目前治疗的诸多方面，从而为我们治疗肿瘤扩大了更广阔的空间。

2 顺铂耐药的机制研究 顺铂(Cisplatin)是最为常见第三代铂类药物

能与肿瘤细胞中的DNA发生交叉联结，从而破坏DNA的功能[14]，从而激活肿瘤细胞的凋亡途径，对多种肿瘤细胞均有很好的杀伤活性。先前成功的案例如在睾丸癌中，联合博来霉素和依托泊苷使顺铂的治愈率高达95%[15]，除了在睾丸癌中突出成功以外，其他广泛的多种实体肿瘤，如卵巢、肺、膀胱、头颈、宫颈肿瘤也被证实对顺铂有高度的反应[16]。虽然顺铂是如此高效，但在治疗周期中获得的固有耐药性和耐药性是相对常见的，这些是目前顺铂抗癌治疗中的主要挑战。产生耐药的原因有许多，比如DNA损伤的识别、HER-2/neu基因的过表达、PI3-K/Akt通路的激活、p53功能的缺失、抗凋亡基因bcl-2的高表达、细胞凋亡途径caspase途径干扰等。顺铂在低氯浓度条件下，通过水合过程变成高度活性的共价顺铂，与DNA碱基结合，形成DNA加合物。顺铂诱导的DNA加合物阻止转录和DNA合成，进而触发复杂的细胞内信号转导级联，细胞有计划地试图消除病变。如细胞周期被阻止，为DNA修复机制移除损伤提供了足够的时间。在修复受损或过度损伤的情况下，细胞会发生凋亡。一旦顺铂引起许多不同的DNA损伤，大多数主要的DNA修复系统都参与消除顺铂引起的DNA损伤。DNA损伤修复有多种方式，比如核苷酸切除修复(NER)、错配修复(MMR)、同源重组(HR)和非同源末端连接(NHEJ)都一起参与了顺铂诱导的DNA损伤后的修复过程。此外顺铂引起的DNA损伤还可以通过一种称为跨病变合成(TLS)的系统简单地复制受损分子来耐受。其中顺铂产生的大量DNA加合物主要由核苷酸切除修复(NER)途径修复。这种修复机制由两条子路组成：全球基因组修复(GGR)，它识别和修复整个基因组的损伤；转录偶联修复(TCR)，它处理主动转录基因的病变。这一系列复杂过程主要由内切酶XPF/ERCC1和XPG主要参与[17]。Ferry等[18]研究表明核酸苷切除修复NER的增强可导致细胞株的耐药,进一步的研究也证实内切修复交叉补体1(ERCC1)的过表达也与顺铂耐药有关。据报道，多个miRNAs通过靶向DNA修复基因参与DNA损伤修复。MiR-192通过抑制HepG2细胞中的ERCC3和ERCC4来抑制NER[19]。在顺铂作用下，过表达miR-33b-3p的A549细胞表现出较低的γH2A.X水平，这就表明miR-33b-3p促进了DNA损伤修复。此外，miR-33b-3p的异位表达增强了ERCC1在A549细胞中的表达，这在NER对顺铂-DNA加合物的修复中起着关键作用[20]。但是miR-33b-3p调控ERCC1表达的分子机制仍需进一步研究。虽然目前尚有机制暂未明确，但是这也无法忽略顺铂化疗治疗睾丸癌在临床上取得的成功。睾丸癌细胞对顺铂的超敏反应反映了临床反应，为了揭示可能解释这种现象的分子机制，人们进行了大量的研究[21]。数据表明，睾丸细胞的DNA修复缺陷是该类型肿瘤对顺铂高度敏感的决定因素。事实上，睾丸细胞系修复铂-DNA加合物的能力低于膀胱系细胞系，无论是在整个基因组中还是在活跃转录的基因中都观察到了这一点。随后，通过测定细胞提取物去除铂-DNA加合物的能力，证实睾丸癌细胞株的DNA修复能力较低，在细胞提取物中加入XPA蛋白足以恢复体外DNA修复能力。有趣的是，在紫外线照射的细胞[22]中没有发现XPA是NER的限速蛋白，后来在用顺铂处理的睾丸癌细胞系中也发现了这一点，这表明低水平的XPA蛋白并不是增加对顺铂敏感性的原因[23]。最近有研究显示与膀胱癌细胞系相比，睾丸癌细胞系被证明具有正常的链内加合物和铂-DNA加合物修复，但ICL修复水平降低。在这些研究中，睾丸细胞中低水平的ERCC1-XPF复合体与低ICL修复密切相关，这种蛋白复合体似乎是这些损伤修复和细胞顺铂耐药的限制因素[24]。顺铂对其他肿瘤具有与一线治疗相似的疗效，这一事实有力地表明DNA修复机制在耐药中起着重要作用，也为miRNA对肿瘤治疗提供了新的研究方向。

3 MiRNA在肿瘤顺铂耐药的作用

miRNA对顺铂转运的调节关键在于细胞内顺铂的浓度。顺铂的耐药性是由于进入细胞的药物被更好地清除，以及细胞被损伤后DNA修复机制的高效率导致的。顺铂被细胞大量泵出，促使细胞内顺铂浓度降低，从而导致耐药。但是由于顺铂转运的方式多样，我们不能简单地通过增加剂量来克服细胞耐药性，因为我们细胞还可以通过调节顺铂的转运蛋白促使细胞耐药。ABC转运蛋白家族(ATP-binding cassette transports Family)是一组跨膜蛋白，具有ATP结合区域的单向底物转运泵，它是以主动转运的方式完成细胞对顺铂的跨膜转运。铜转运P型三磷酸腺苷ATP7A和ATP7B是目前研究发现促使铂类药物流出细胞的两类转运蛋白，这两类转运蛋白在顺铂耐药的细胞中明显高表达[25-26]促使顺铂转运能力下降，进一步导致耐药。Song等[27]研究发现，miR-495-3P可靶向下调ATP7A促使细胞对顺铂耐药。在ATP7A的30个非编码区中，miR-495有3个结合位点，miR-495的抑制对携带第一和第二miR-495结合区突变的载体中的GFP强度没有影响，但阻断miR-495会影响含有第三结合位点突变的突变载体中的EGFP强度。可以解释的是，第三个结合位点在miR-495对ATP7A的调控中起着次要的作用。在70%的食管癌患者肿瘤细胞中存在金属硫蛋白的过表达，它的过表达被发现与顺铂的耐药性有关[28]。

miRNA对细胞周期的调节 细胞周期依赖性激酶(CDK)是一组丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其主要作用是控制细胞周期转换。这些酶包含两个亚基，一个催化CDK亚基，一个激活CDK的调节周期蛋白亚基。两类细胞周期蛋白-CDK调节细胞从静止状态进入S期：D型细胞周期蛋白激活CDK4/6，细胞周期蛋白E激活CDK2。细胞周期蛋白E2是细胞周期蛋白E家族的成员，其主要功能是通过CDK2的结合和Rb蛋白的磷酸化使细胞从G0/G1期过渡到S期[29-30]。miR-25在小细胞肺癌细胞和人小细胞肺癌肿瘤组织中均过表达，在H510A细胞中下调miR-25-3P的表达不仅可以降低肿瘤细胞对顺铂的耐药性，而且同时可以降低其生长速度和侵袭能力。通过进一步研究发现下调miR-25-3P能导致下游因子CDK2和CyclinE的表达量降低，从而诱导细胞周期G1阻滞[31]。miR-545在肺癌组织中不如在邻近的非癌性组织中丰富.这表明miR-545在肺肿瘤中表达不足，可能作为肿瘤抑制因子发挥作用。研究证实细胞周期蛋白D1和CDK4基因是miR-545的直接靶标,miR-545在G0/G1期诱导细胞周期停滞，因此也让miR-545成为肺癌治疗的潜在靶点[32]，进一步印证了miRNA对细胞周期影响顺铂耐药。

miRNA对EMT的调节 EMT这一过程始于原发肿瘤，癌细胞失调细胞黏附，下调E-cadherin等蛋白质，上调Vimentin和N-cadherin等更具运动性、间充质样表型的蛋白质。这一系列过程被称为上皮向间充质转化(EMT),EMT是上皮细胞来源的恶性肿瘤细胞获得迁移和侵袭能力的重要生物学过程[33]。同时通过研究也发现EMT是NSCLC细胞对顺铂产生耐药的重要原因之一[34]。Demin Jiao研究[35]通过PC-9细胞和HCC-827细胞的EMT标志物E-cadherin和Vimentin的免疫荧光染色证实，miR-1-3p和miR-206抑制了Akt和Erk途径下游的c-Met，并阻断了HGF诱导的上皮-间充质转化(EMT)，这一证据提示miR-1-3p和miR-206逆转HGF刺激的肺癌细胞EMT可能是克服吉非替尼耐药的另一个重要机制。顺铂耐药的肺腺癌细胞表现出EMT特征并增强多药耐药1(multiple drug resistant，MDR1)基因MDR1的表达，以往的研究表明化疗药物可以诱导EMT，增强侵袭能力，导致耐药[36-37]。Snail和ZEB1是两个重要的EMT诱导剂[38]。多药耐药基因1(MDR1，ABCB1)编码P-糖蛋白(P-gp)，通过降低药物有效细胞内浓度，成为耐药的药物载体之一促进耐药[39]。Qing等[40]发现miR-206在人肺腺癌顺铂耐药细胞中的过度表达通过靶向MET并抑制其下游PI3K/AKT/mTOR信号通路来抑制EMT和顺铂耐药。通过检测PI3K选择性抑制剂LY294002或mTOR抑制剂雷帕霉素处理A549/DDP细胞后发现miR-206的低表达和高水平的MET与肺腺癌患者顺铂敏感性差密切相关，Snail和ZEB1等EMT相关转录因子的表达减少是miR-206水平下调到EMT的分子机制之一。miR-206的激活或其靶基因途径的失活可能是逆转人肺腺癌顺铂耐药细胞顺铂耐药性的潜在策略。此外miRNA也能通过诸如细胞凋亡途径、细胞自噬等多种方式影响细胞耐药，以上多种形式和通路的出现也为miRNA的影响顺铂耐药提供了新的研究思路，为我们解决耐药提供了更加广阔的前景。

4 肺癌中MiRNA的研究进展

肺癌是我国发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，2015年我国新发肺癌病例约为73万，因肺癌死亡病例约为61万人，严重威胁人类健康。目前尽管肺癌的多种治疗模式，诸如手术、化疗、分子靶向治疗、放射治疗、免疫治疗等越来越趋于规范，同时以基因测序等更加精准的检测手段的出现，肺癌诊断和治疗取得了长足的进步，但是由于肺癌患者早期症状不明显，很大一部分患者在确诊肺癌时达到Ⅲ期，其中超过50%仅接受手术治疗的肺癌患者会在5年内出现肿瘤复发或远处转移，进而导致治疗的失败。尽管目前治疗手段如此繁多，但是肺癌的治疗仍旧很难取得进展，这也从另一方面激励着miRNA的研究的不断深入。

miRNA抑制肺癌转移MiR-138-5p被认为是一种肿瘤抑制因子，它与癌旁组织相比，miR-138-5p在许多癌组织中的表达降低，并且miR-138-5p的表达降低与患者的临床病理因素和生存不良密切相关。在非小细胞肺癌病例中，miR-138-5p参与GADD45A的升高并抑制细胞生长。miR-21的靶点已被证明是多个肿瘤抑制基因的mRNA，包括PTEN、PDCD(programmed cell death)、TPM1(tropomyosin 1)和SerpinB5(serpin peptidase inhibitor, cladeB member 5)基因，这些基因不仅对癌细胞恶性转化起负调控作用，而且能够抑制细胞运动和侵袭。

miRNA与肺癌放射治疗 放射治疗(RTH)的主要目的是通过电离辐射破坏肿瘤细胞，这可以导致患者康复(根治性放射治疗)或者缓解与局部肿瘤发展或转移相关的疾病症状(姑息性放射治疗)。这两种治疗方案对诊断为非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)的患者尤其重要。根治性放射治疗常应用于NSCLC的Ⅲ期，以及早期(I-II期)的患者，除非肿瘤相关原因而丧失手术资格或因患者决定退出手术。然而，根治性放射治疗的研究结果仍不令人满意。只有大约20%的I、II期患者和高达10%的III期患者实现了5年生存率。在Wang等研究中发现miRNA-21与细胞对辐射反应的相关性。在6Gy剂量辐射后分别在0、2、4、6和8小时检测A549细胞中miRNA-21的表达。辐射后miRNA-21表达增加。其水平在4小时后增加，这一现象可能与其调节细胞对RTH的反应有关。为了证实这些发现，进一步研究表明通过RNAi在A549细胞中敲除了miRNA-21，然后将细胞暴露在辐射中。结果表明，经miRNA-21基因敲除的A549细胞的存活率明显低于对照细胞。此外，miRNA-21基因的下调抑制了A549细胞的生长和增殖。综上所述，由于miRNA-21的低表达抑制了A549细胞的增殖，并使细胞对辐射敏感，因此miRNA-21被认为是一种可能的新的RTH应答标志物。此外他们还研究了miRNA-21的另一种作用机制。研究结果表明，miRNA-21的过表达增加了A549细胞的辐射抗性，上调了EGFR/HER2信号通路，这可能与上皮-间充质转化(细胞侵袭、迁移和血管化)EMT有关。在小鼠模型中，与单独治疗相比，联合应用抗miRNA-21和放射治疗可逐渐降低肿瘤负担。miRNA-21具有辐射抗性和不同的上皮-间充质转化特征。MiRNA-21的下调可能是一种新的潜在策略，通过调节辐射反应和上皮-间充质转化中涉及的促生存信号来提高RTH的效率。其他几种miRNAs作为癌细胞对辐射反应的标志物也被研究过。在A549细胞系中，miRNA-451也可能参与其中。miRNA-451的过表达可增强辐射对A549细胞集落形成能力的抑制作用，也可通过激活PTEN的表达来增强辐射对A549细胞集落形成能力的抑制作用。这两种机制都可能通过促进细胞凋亡而导致肺癌细胞的放射增敏。

5 miRNA的前景展望

顺铂在抗肿瘤药中属于研发较早、临床应用较广并且作用较为显著的一种肿瘤治疗药物，但是耐药性同时限制了顺铂的治疗，这一限制同时也是化学治疗上面临的主要挑战。miRNA在肺癌顺铂耐药性中的研究尚处于初级阶段，大量通路机制尚不明确，目前已经知道miRNA可调控约三分之一的蛋白编码基因的表达，影响着一些信号传导通路，我们通过在不同肿瘤组织中miRNA表达水平的研究和分析发现，miRNA通过调节肿瘤耐药及影响肺癌细胞的恶性生物学行为如肿瘤的转移与侵袭、肺癌细胞的增殖与凋亡、肿瘤血管新生，参与肺癌的发生与演进过程，为肺癌临床治疗提供了新思路。同时miRNA也是具有巨大潜力的分子标志物,以miRNA为靶点设计新的药物将为阻断肿瘤转移、改善患者预后提供更加有效的治疗途径。随着研究深入我相信有效的miRNA调节剂将会在不远的未来出现，会为肿瘤治疗开辟新的治疗手段。