通过LPS-TLR4/MD-2-TNF-α信号通路探讨酒精性肝病发病机制

牟文玲 陈事如 吴振婷 常鸿杰 冯梦瑶 周航 胡立华

酒精性肝病（alcoholic liver disease，ALD）是由于长期大量饮酒导致的一组肝脏疾病的总称。世界各国的发病率和随之带来的经济负担均随着社会经济发展呈上升趋势[1-4]，是国内外肝脏疾病研究的重点，酒精已成为继病毒性肝炎后导致肝脏损害的第二大病因，ALD正在成为威胁人类健康的全球性公共卫生问题，对其发病机制的探索和研究刻不容缓。ALD做为临床常见的肝脏疾病，因其发病机制不明，一直缺乏行之有效的治疗。一旦发病过程中的扳机机制启动，患者即使严格忌酒，仍无法控制疾病的进程。而临床多采取简单的保肝降酶对症治疗，无法从根本控制或逆转肝脏病理生理改变。如明确LPS-TLR4/MD-2-TNF-α通路的作用环节以及该信号通路在酒精性肝损伤中的作用机制，可为筛选治疗ALD的分子靶点提供实验依据，本课题从体外、体内两方面研究探讨该信号通路的影响和作用机制，同时选择性阻断LPSTLR4/MD-2-TNF-α信号通路分子，探讨该通路在ALD中的作用机制。为防治ALD提供科学依据并为寻找新的治疗靶点提供理论基础和研究方向。

1 资料和方法

1.1 一般资料

SD雄性大鼠，ALD大鼠尾静脉注射内毒素LPS 50 μg/kg，鼠重90 min。选择性体内阻断剂分别应用大鼠anti-TLR4、anti-MD-2（以上来自Abcam公司）经腹腔注射治疗。试剂：40%酒精、50%酒精、水合氯醛、选择性体内阻断剂。仪器设备：超速和高速离心机；PCR仪；电转移仪；芯片扫描仪、芯片杂交仪、自动基因序列分析仪、DNA合成仪、凝胶成相分析仪，高效液相分析仪，基因芯片点样仪、自动基因序列分析仪、-80℃低温冰箱和Parmacia电泳仪等。

1.2 研究方法

1.2.1 体内研究 将大鼠适应性饲养1周后，大鼠按每周测定的体质量每日早晚各给予1次白酒灌胃，前4周每日给予40%酒精灌胃（8 g/kg），2次灌胃时间间隔超过8 h，自第5周开始，每日给予50%酒精灌胃（9 g/kg），至8周末。任取灌胃8周末一只大鼠禁食12 h后，以10%的水合氯醛3 mL/kg进行麻醉，取血液离心采用分光光度法分别检测血清ALT、AST、ALP、GGT、TCH、TG、TB。取出肝脏，用于常规石蜡包埋切片，常规HE染色并观察其肝脏的组织学改变及超微结构的改变、备用。

观察项目：

（1）取肝脏进行组织培养并测定培养液中TNF-α的含量：取肝组织约10 mm×4 mm×0.4 mm，在冰浴的William's E medium培养液中洗去血液，放入含10%小牛血清的William's E medium培养液中进行组织培养（5%CO2，18%O2，37℃），每个培养瓶中放入两块上述大小的肝组织。取不同时间点（0 h，1 h，2 h）的培养上清测定TNF-α的含量（以每克组织定量），并测量培养瓶中的肝组织重量。

（2）肝组织中LBP、CD14、TLR4、MD-2、TNF-α蛋白表达变化：Western blot方法检测。

（3）肝组织中LBP、CD14、TLR4、LBP、MD-2、TNF-α m RNA表达：real time RT-PCR方法检测。

（4）肝组织中NF-κB活性：Western blot和EMSA方法检测。肝组织学损害用HE、PAS和Masson’s染色病理切片进行评估。

1.2.2 体外研究 分离ALD大鼠模型肝脏Kupffer，常规建立细胞培养体系。分别采用TLR4/MD-2过表达慢病毒载体及RNAi转染肝脏Kupffer，检测Kupffer表型及功能的变化、TLR4/MD-2通路相关分子的表达变化以及细胞因子产生的变化。

1.3 观察指标

选择表达绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的慢病毒（lentivirus）载体包装质粒：pRsv-REV、pMDlg-pPRE和pMD2G包装质粒，同时分别构建含TLR4和MD-2特异性siRNA序列的质粒，用表达相应基因的siRNA病毒分别感染肝脏Kupffer细胞，分别干扰TLR4和MD-2的表达。以表达无功能siRNA慢病毒为阴性对照。以实时定量RT-PCR和Western blot检验慢病毒siRNA的基因沉默效果，每个基因设计2～3条siRNA，选取基因沉默效果最佳者进行实验。用流式细胞仪检测表达GFP细胞比例，监测慢病毒对细胞的感染效率。

1.4 统计学方法

临床观察记录、临床试验资料和数据由专人管理。计量资料组内前后对照采用配对t检验，采用（±s）表示，组间差异显著性采用单因素方差分析，两两比较采用S-N-K检验。计数资料用χ2检验，采用（n，%）表示，相关分析采用Pearson相关系数或者Spearman秩相关系数，统计分析用SPSS 20.0统计软件包进行。

2 结果

实验发现：在显著性差异表达的Pathway中LPS代谢通路呈上调趋势，且有多个差异miRNA同时调控此代谢通路。同时选择性阻断LPS-TLR4/MD-2-TNF-α信号通路分子，可以降低乙醇在肝细胞内代谢产生的毒性代谢产物及引起的代谢紊乱，减缓炎症反应引起的损伤。

3 讨论

内毒素主要成分是脂多糖（LPS），是肠道革兰氏阴性细菌外膜的重要组成成分，在菌体自溶或被裂解时释放出来。长期大量的饮酒，可刺激肠道致损伤，使肠道菌群上移，引起内毒素肠渗漏，使血中内毒素含量升高，即肠肝循环。临床研究表明，酒精性肝病患者血浆内毒素水平较正常受试者及非酒精性肝硬化患者升高，动物实验亦有类似结论[5-7]。现有研究支持LPS—Kupffer细胞活化—TNF-α等细胞因子分泌—肝脏炎症损伤这一途径：即LPS进入血液后，通过LPS的结合蛋白LBP与Kupffer细胞膜表面的内毒素受体（endotoxin receptors on Kupffer cell membrane，CD14）结合，经跨膜受体TLR4等Toll样受体家族（Toll like receptors，TLRs）参与，完成LPS跨膜信号转导进入胞内，激活肝Kupffer细胞，使存在于胞浆的I-κB磷酸化释放NF-κB（nuclear factor-kappa B）。NF-κB进入细胞核，与靶基因启动子区域的特定序列结合，从而启动炎症因子如肿瘤坏死因子（tumour necrosis factor-α，TNF-α）的转录。TNF-α等促炎因子的存在又可进一步活化NF-κB，形成恶性循环。TNF-α是Kupffer细胞活化产生的主要炎症细胞因子，通过其受体TNFR1发挥多种细胞效应，如通过活化内皮细胞发挥促中性白细胞聚集的效应，诱导细胞线粒体肿胀、破坏及细胞凋亡坏死，从而发生肝损伤。

新近的研究发现TLR4介导的LPS信号转导需要一种称为髓 样 分 化 蛋 白 -2（myeloid differentiation protein-2，MD-2） 的辅助[8-13]：血浆中的LPS首先和肝脏产生的LPS结合蛋白（LPS binding protein，LBP）结合，由LBP将LPS转运到CD14（cluster of differentiation-14）。但是CD14缺乏跨膜区和胞浆内段，不能将LPS信号转导到细胞内，因此它只能将LPS传递给下游的TLR4/MD-2受体复合物。最近研究报道LPS可上调Kupffer细胞中TLR4/MD-2基因和蛋白的表达，并合成细胞因子TNF-α，抗TLR4的抗体能抑制LPS诱导的TNF-α的生成，TLR4/MD-2单克隆抗体可以保护肝脏免于LPS引起的致死性肝损伤。TLR4和它伴侣分子MD-2可能在LPS—Kupffer细胞活化—TNF-α等细胞因子分泌—肝脏炎症损伤这一途径中发挥受体结合、促细胞因子分泌的重要作用。

本课题从体外、体内两方面研究：体外观察LPS诱导kuffer细胞产生TNF-α的干预的作用和强度。体内研究采用大鼠LPS尾静脉注射诱导TNF-α释放的模型，分离肝脏进行体外组织培养，探讨该信号通路的影响和作用机制，同时选择性阻断LPS-TLR4/MD-2-TNF-α信号通路分子，探讨该通路在ALD中的作用机制。实验发现：在显著性差异表达的Pathway中LPS代谢通路呈上调趋势，且有多个差异miRNA同时调控此代谢通路。

综上所述，通过体内特异性单抗阻断LPS-TLR4/MD-2-TNF-α信号通路可以降低乙醇在肝细胞内代谢产生的毒性代谢产物及引起的代谢紊乱，减轻炎症反应引起的损伤。本课题可为筛选治疗ALD的分子靶点提供实验依据，为防治ALD提供科学依据并为寻找新的治疗靶点提供理论基础和研究方向。