关系酱油酿造中谷氨酸生成的谷酰胺酶基因确认

伊藤考太郎 小山泰二等

利用基因研究成果，从基因上水平搞清谷酰胺酶。采用计算机模拟（in silico）分析与已知谷酰胺酶相同的基因得知，有4种类型共10个谷酰胺酶基因存在，即在曲菌A.sojaeNBRC4239的基因排列中，与源自Cryptococcus nodaensis耐盐菌的谷酰胺酶有相同性的Ⅰ型、与有Bacillus subtillis谷酰胺酶活性的谷酰胺转肽酶有相同性的Ⅱ型、与某报告中说系出自A.oyzae谷酰胺酶的gtaA基因有相同性的Ⅲ型，以及与来自Micrococcus luteus的耐盐性谷酰胺酶有相同性的Ⅳ型。

为了搞清是哪种谷酰胺酶在酱油酿造中发挥了作用，单独制作了10个谷酰胺酶基因的破坏菌株，然后检测各破坏株的谷酰胺酶活性发现，Ⅰ型的gahB基因被破坏后，谷酰胺酶的活性降到1/10以下，但用该菌株试酿的酱油其谷氨酸量几乎未减少。接着，对这10个基因按类型分别进行多次基因破坏，然后将它们组合起来再进行多次基因破坏，最后制作了将所有谷氨酸酶基因全部破坏的菌株。试酿酱油使用了上述Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅳ型基因同时被破坏7次，和谷酰胺酶基因全部被破坏的菌株，其酶活已经降到1/100以下，所得酱油的谷氨酸含量降低了60%，同时焦谷氨酸含量有所上升，减少的谷氨酸量与推定的由谷酰胺酶反应生成的量基本一致。另外，将7个基因进行各种组合并作多处破坏后制成菌株，发现若将其Ⅰ型gahA、hahB、Ⅱ型gahA和Ⅳ型的gls这4个基因同时破坏则可得到同样的结果，搞清了酱油酿造中谷氨酸生成与这4个谷酰胺酶的相互辅佐有关。

用对上述4个谷酰胺酶进行2～3次基因破坏制成的菌株试酿酱油，结果虽未看到⊿gahA、⊿ggtA-⊿gls和⊿gahB-⊿ggtA-⊿gls3次基因破坏菌株的谷氨酸含量下降，但观察到⊿gahA-⊿gahB的2次基因破坏株的谷氨酸生成量下降了20%～30%。将这2个GahA和GahB的蛋白质精制，并对各性质定性后确认，它们不仅是谷酰胺，也是能作用于肽谷酰胺的肽谷酰胺酶，要在酱油酿造中得到高含量的谷氨酸，该酶的反应是十分重要的。