以玉米为例探究单子叶植物重力响应及维管结构的变化*

2021-04-02贺学娇楚立威文爽爽卢孟柱

林业科学 2021年2期

贺学娇楚立威文爽爽卢孟柱,2,3 唐芳,3

(1.中国林业科学研究院林业研究所林木遗传育种国家重点实验室国家林业和草原局林木培育重点实验室北京 100091；2.浙江农林大学省部共建亚热带森林培育国家重点实验室杭州 311300；3.南京林业大学南方现代林业协同创新中心南京 210037)

环境条件对植物生长发育有着重要的影响，当外界条件(光照、湿度、温度、重力等)改变时，植物会快速感知并通过调节自身生长状态来适应新的环境。在这些环境因素中，重力因其发挥作用较为稳定且持续存在，对植物的生长发育、形态建成、生理代谢等生物学过程发挥着巨大的作用(Volkmannetal., 2006)。不同的植物类群及植物器官已经具备完整的进化机制，能够调节与重力作用相关的生长和定向变化(Gerttulaetal., 2015)。人们将植物能够根据重力的作用方向来调节自身生长方向的能力称为向重力性。目前植物对于重力作用的反应过程大致分为4个阶段：对重力信号的感受、对重力信号的转导、调节生长素进行不对称分布以及反应器官弯曲生长(Strohmetal., 2012)。

研究表明，当改变树木正常垂直生长的方向时，会诱导形成弯曲或倾斜的树干，树木在调整恢复枝干的垂直生长方向或维持树枝的自然角度方向时，由于形成层在茎干一侧的活动增加，导致茎干发生不对称生长，从而使构成次生木质部的各种细胞比例及次生壁超微结构发生一定改变(Ruelle, 2014)，形成在化学组成及物理力学性质等方面明显不同的木材，这种特殊的木材组织就是应力木 (reaction wood)(Fournieretal., 2014)。在形成层的作用下，应力木通常只出现在枝干或枝条的一侧。在裸子植物中主要形成于茎或枝的近地侧，称为应压木(compression wood)(Ruelle, 2014)；在被子植物中，则主要位于茎或枝的远地侧，称为应拉木(tension wood)(Mellerowiczetal., 2012)。相对于应力木，枝干另一侧形成的对立木(opposite wood)没有明显的特征变化。

不同于双子叶植物具有连续的形成层组织能够不断进行木质部的分化(木材形成)，单子叶植物的维管束是散生的且大多没有形成层，其禾本科(Gramineae)植物茎的生长主要依靠节间基部的居间分生组织自下而上进行分裂活动(刘江伟等，2014)。当重力条件改变时，单子叶植物会感受重力刺激发生向性生长，反应部位两侧生长素会发生不对称分布，导致两侧细胞差异生长，最终造成一定方向上的弯曲(Perrinetal., 2005)。但是目前单子叶植物在响应重力刺激发生植株弯曲生长过程中产生的结构变化还不是很清楚，特别是重力诱导后其维管组织有什么变化，与木本植物的应力木有什么区别，是值得研究的问题。另外，竹子(Bambusoideae)与玉米(Zeamays)都属于单子叶植物，通过对玉米重力诱导，将有利于了解单子叶植物在重力诱导下的维管组织特性，对于竹子等单子叶植物重力响应的研究具有重要的意义。玉米作为典型的单子叶禾本科植物，已经完成了全基因组的测序(Weietal., 2009)，并且具有易栽培、生长快，茎秆坚硬、直立等特点，适合进行重力响应研究。本文对玉米在重力响应过程中发生的形态变化、组织结构变化及细胞壁成分变化进行了研究分析，确定了其维管组织的变化特征。研究结果不仅为了解单子叶植物对重力作用的反应机制提供了依据，也将有利于对裸子植物、双子叶植物和单子叶植物重力响应的异同点进行分析，为进一步研究单子叶植物如竹类及其他林木的重力响应机制提供了基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本文中的所有试验材料均为玉米B73自交系，种子由中国农业大学农学与生物技术学院提供。先将营养土和蛭石按照1∶1体积比混合后装入口径约20 cm的培养钵中，之后把种子直接点播在土里。播种后的玉米先于人工气候室(温度24～25 ℃，光照/黑暗14 h/10 h)培养至2叶期，再将其转移至温室继续培养(培养温度大约在25～30 ℃，光照/黑暗14 h/10 h)，待玉米幼苗发育至10叶期后进行重力试验处理。玉米幼苗种植和重力试验于2019年4—8月间重复进行5次。

1.2 试验方法

1.2.1 重力响应试验将10叶期的玉米苗直接水平放倒(图1)，并调整茎秆位置使其对生叶片自然均匀分布于茎秆两侧，植株与地面平行，对照植株保持直立生长。每次试验设置同期同状态的3～4株玉米进行重力响应处理，另外3～4株作为对照。试验组和对照组植株都在相同的环境条件下生长，并保证植株土壤有足够的水分。使用Wingscapes timelapsecam相机(WINGSCAPES，美国)对放倒的植株进行连续拍照，时间间隔设定为每张10 min，记录玉米在重力响应过程中的表型变化。重力响应试验先后重复5次。

1.2.2 材料获得及组织切片当处理的玉米植株到重力响应的终止状态后，将茎节处着生的叶片剥离，使茎秆上各茎节裸露出来。对发生形态变化的玉米茎节和部位进行表型观察和拍照记录，并做组织切片分析，取样部位在茎节上下各1.5 cm处。对照植株也截取相对应的部位进行切片。

对上述选取的材料分别进行横切和纵切。由于发生形态变化的玉米茎节在近地侧部分发生膨大和弯曲变化，而远地侧无明显变化，故以横截面上近地侧与远地侧的中间位置为切入点将样品一分为二。一份进行纵切，以便获得茎节在纵切面上的形态变化；另一份进行连续的横向切片，从中明确表型变化最明显的部位。之后对该部位进行茎段的完整横切，从而观察茎节在横切面的结构变化。上述所有组织切片均使用LEICA VT100 S振荡切片机(Leica，德国)进行快速振荡切片，其中纵切厚度为80 μm，横切厚度为70 μm。

1.2.3 运用不同染色方法对组织结构进行观察甲苯胺蓝(简称TBO)为碱性染料，组织中的酸性物质能与TBO染料中的阳离子相结合而被染色。植物细胞中，栓质化组织、木质化细胞壁染色呈现蓝绿色；非木质化(如多糖类性质)细胞壁呈现红紫色；蛋白质以及含蛋白质混合物则被染为蓝色或蓝紫色(张仲鸣等，1997)。0.05% TBO染色时间约为30 s，冲洗3次后进行观察。

间苯三酚可以在酸性环境下与细胞壁中的木质素特异结合发生樱桃红或者紫红色反应，是植物显微化学中确定木质化细胞壁的最常用和最简单的方法。将3% 间苯三酚溶液与37% 浓盐酸按照2∶1体积混匀成间苯三酚-HCl溶液进行染色。染色时间约为1 min，冲洗3次后进行观察。

Calcofluor White(简称CFW)染料是一种荧光增白剂，与多种植物及真菌细胞壁的纤维素有很强的亲和力，表达出很强的亮蓝色荧光。本试验直接使用Calcofluor White染色液成品(Sigma，#18909)滴染样品，染色时间为1 min，冲洗3次后进行观察。

染色后的组织切片均在Olympus BX51显微镜(Olympus，日本)下观察并拍照记录。其中，TBO、间苯三酚-HCl染色的切片只需在明场下观察，而Calcofluor White染色切片则需在紫外光(330～400 nm)下进行。因玉米样本面积过大，需使用CellSens标准软件在10倍物镜下进行图像拼接才得到完整图像。

2 结果与分析

2.1 玉米响应重力的形态变化过程

当重力条件改变以后，玉米会迅速感应重力信号，植株形态也随之发生变化。重力处理的玉米延时拍摄显示，玉米植株响应重力作用后发生了明显的动态变化(图1)。从玉米植株水平放置后的0 h到第5 h，植株形态基本没有发生变化(图1A、B)；到第10 h，植株顶端响应重力条件的改变而向上弯曲翘起(图1C)；之后玉米植株快速持续地向上弯起，直至第94 h植株形态不再发生明显变化，向上弯起的茎秆保持与水平面垂直的状态继续生长(图1D-F)。

图1 玉米植株重力响应过程中不同时间点的形态Fig. 1 Morphology of maize plants at different time during gravity response processA: 0 h; B: 5 h; C: 10 h; D: 20 h; E: 30 h; F: 94 h, 重力响应的终止状态 The permanent status of maize plant response to gravity.

为了便于对多次重复的重力试验进行数据统计，以第1片旗叶着生的节作为第1茎节，从下往上依次标记茎节。统计结果(表1)表明，第1、2、3茎节在多次试验中均未发生形态的变化，而植株顶端在水平放置后的第8～10 h左右响应重力作用开始翘起；随后大约2 h后，第6茎节响应重力开始向上弯起；约10 h后，第5茎节响应重力并向上弯曲生长；再过大约10 h，第4茎节也开始向上弯曲生长。此后直至玉米植株重力响应的终止状态，第4、5、6茎节持续保持弯曲生长，使得玉米植株与水平面的夹角逐渐增大，直至最终呈90度角，玉米顶端恢复直立生长状态。

表1 玉米不同茎节响应重力的时间节点统计Tab.1 The statistics of time that different stem nodes response to gravity in maize

剥离玉米植株叶鞘处着生的叶片后可以看到，只有第4、5、6茎节靠近节的位置发生了明显的弯曲生长，近地侧部位出现了不同程度的膨大变化(图2)，从而使这3个茎节在近地侧和远地侧发生不对称生长。相比之下，直立放置的玉米对照植株相对应的茎节部位并未出现形态的改变。

图2 玉米植株第4、5和6茎节的外观形态Fig. 2 Morphology of the fourth, fifth and sixth stem nodes of maize plantsA-C: 直立生长的对照植株茎节部位； D-F: 重力响应植株的茎节部位。A, D：第6茎节； B, E：第5茎节； C, F：第4茎节。比例尺：5 mm。A-C: The stem nodes of the control plants growing vertically; D-F: The stem nodes of the plants response to gravity. A, D: The sixth stem node; B, E: The fifth stem node; C, F: The fourth stem node. Scale bar: 5 mm.

2.2 玉米不同茎节响应重力作用后的显微结构变化

对玉米第4、5、6茎节的纵切切片进行结构观察，发现不同茎节之间结构变化趋势基本一致。由图3纵切结果可知，对照组茎节两侧生长状态基本一致，导管系统均匀地直立分布；而响应重力改变的玉米茎节发生了形态结构的变化，近地侧向上弯曲生长，远地侧只发生轻微弯曲，同时茎节内部的维管组织也相应地发生结构变化并呈现弯曲分布的状态。

图3 玉米植株第5茎节的纵切显微结构Fig. 3 Longitudinal microstructure of the fifth stem node of maize plantsA: 直立生长的对照植株; B: 重力响应植株。A: The control plants growing vertically; B: The plants response to gravity.

在前期试验结果基础上，选取不同茎节变化最为明显的部位进行完整的横切切片，TBO染色后进行结构对比观察。由图4可知，玉米在直立生长状态下，第4、5、6茎节的横切面呈圆形，维管束结构、大小近乎一致而且均匀地分布(图4A-C)。在重力条件改变后，玉米茎节近地侧发生膨大，从横切可以看出，第4、5、6茎节近地侧膨大部位的维管束均较对照植株大，呈现为纺锤形且没有明显的导管组织(图4D、E、F)，维管束细胞数量显著增多、细胞壁极显著变薄(图5)。而3个茎节远地侧最外层维管束与对照相比变化不一，其中第4茎节的维管束面积增大、细胞数量明显增多，细胞壁显著增厚；第5茎节的维管束细胞数量与对照无明显差异，细胞壁显著变薄；第6茎节维管束的细胞数量增多，细胞壁也显著变薄。由此看出，受重力作用后的3个茎节，由于生长发育状态的不一致，响应重力的作用不同，其结构变化也有所差异，其中第4茎节近地侧和远地侧的维管束变化最为显著。

图4 玉米第4、5、6茎节的显微结构变化Fig. 4 The anatomical change of the fourth, fifth and sixth stem nodes of maize plants茎节横切面TBO染色结果。A-C: 直立生长的对照植株； D-F:重力响应植株。A, D: 第4茎节; B, E: 第5茎节; C, F: 第6茎节。每个完整图右侧的4个图是对应部位(红框)维管束的放大图；40×比例尺为50 μm，100×为20 μm。TBO stained cross sections. A-C: The control plants growing vertically; D-F: The plants response to gravity. A, D: The fourth stem node; B, E: The fifth stem node; C, F: The sixth stem node. The four pictures on the right side of each complete picture are magnified pictures corresponding to the labeled area with red rectangle, respectively. The scale of 40× is 50 μm, and 100× is 20 μm.

图5 玉米对照植株和重力响应植株第4、5、6茎节的维管束细胞数量和细胞壁厚度Fig. 5 The cell number and cell wall thickness of vascular bundles in the fourth, fifth and sixth stem nodes between maize control plants and gravity response plantsCK: 对照; D-d: 重力-远地侧; D-p: 重力-近地侧。CK: Control； D-d: Gravity-distal； D-p: Gravity-proximal. **: P<0.01.

2.3 重力诱导后细胞壁成分变化

根据TBO染色结果可以看出远、近地侧维管束细胞壁厚度的差异及着色不同，推测2个部位的细胞壁成分如木质素、纤维素等的含量也可能存在差异。因此，使用木质素和纤维素特异染料对重力响应植株和对照植株的茎节横切切片进行染色和比较(图6)。

图6 玉米第4、5、6茎节的木质素含量变化Fig. 6 The lignin content change of the fourth, fifth and sixth stem nodes of maize plants茎节横切面HCl-间苯三酚染色结果。A-C: 直立生长的对照植株； D-F: 重力响应植株。A, D: 第4茎节; B, E: 第5茎节; C, F: 第6茎节。每个完整图右侧的4个图是对应部位(红框)维管束的放大图； 40×比例尺为50 μm，100×为20 μm。HCl-phloroglucinol stained cross sections. A-C: The control plants growing vertically; D-F: The plants response to gravity. A,D: The fourth stem node; B,E: The fifth stem node; C,F: The sixth stem node. The four pictures on the right side of each complete picture are magnified pictures corresponding to the labeled area with red rectangle, respectively. The scale of 40× is 50 μm, and 100× is 20 μm.

由图6染色结果可以看出，玉米对照植株茎节内的维管束都能被间苯三酚染色，其中导管部位被染成桃红色。重力响应植株的茎节中，远地侧的维管束也能被间苯三酚染色，但近地侧的维管束着色较浅，导管部位呈现微弱的红色。说明近地侧维管束的细胞壁中木质素含量低于对照，而远地侧维管束细胞壁中木质素含量与对照相比没有明显变化。

同时，纵向比较不同茎节染色结果也可以看出，位于植株下方位置的第4茎节比第5、6茎节染色程度更深，说明3个茎节之间因发育程度的差异也会造成维管束木质素含量的差异。

通过CFW染色，可以分析细胞壁中纤维素的变化。以第4茎节染色结果为例(图7)，对照组玉米茎节靠近表皮的维管束中，木质部和韧皮部位置均能被CFW染色并在紫外下呈现亮蓝色，而维管束鞘部位着色极浅，在紫外下只有微弱的蓝色可见。在重力作用后的茎节中，远地侧的维管束和对照植株维管束染色结果一致，维管束鞘细胞壁也只呈现微弱的蓝色；而近地侧膨大部位的维管束几乎都能被染色而呈亮蓝色。这个结果与间苯三酚染色结果相对应：在远地侧表皮维管束中，维管束鞘部位能被间苯三酚染色，但CFW染色较浅；而近地侧膨大部位的维管束间苯三酚染色较浅，但能被CFW染色并呈亮蓝色。说明近地侧维管束的细胞壁成分与对照维管束细胞壁成分有较大差别，即近地侧维管束中细胞壁的纤维素含量较高，而木质素较低。这可能是由于受到重力作用后，近地侧维管束的细胞数量增多，细胞壁发生了重构，新生的细胞壁多为未次生加厚的初生细胞壁。

综上所述，玉米在感应重力条件改变后，会迅速调整茎节延伸的方向，在茎节近地侧出现明显的组织膨大。与对照维管束相比，近地侧维管束的细胞数量增多，细胞壁厚度显著变薄，木质素含量降低，纤维素含量增加；远地侧维管束的结构和细胞壁成分没有明显的变化，但细胞数量和细胞壁厚度发生了一定改变。

图7 玉米第4茎节的纤维素含量变化Fig. 7 The cellulose content change of the fourth stem nodes of maize plants茎节横切面Calcofluor White染色结果。A：直立生长的对照植株； B：重力响应植株。每个完整图右侧的小图是对应部位(红框)维管束的放大图(40×)； 40×比例尺为50 μm。Calcofluor White stained cross sections. A: The control plants growing vertically; B: The plants response to gravity. The small pictures on the right side of each complete picture are magnified (40×) pictures corresponding to the labeled area with red rectangle, respectively. The scale of 40× is 50 μm.

3 讨论

重力对植物的生长发育、形态建成、生理代谢等生物学过程发挥着重大作用，特别是对植物自身生长方向的变化起到关键作用(Volkmannetal., 2006)。在以杨树(Populus)和松树(Pinus)为代表的双子叶植物和裸子植物中，对重力响应的反应和机制开展了大量的研究。当重力条件改变时，杨树会被诱导形成弯曲或倾斜的树干，在远地侧形成应拉木，近地侧形成对立木。由于应拉木侧的形成层活动增加，最终形成偏心生长的年轮；应拉木的导管减少，纤维细胞增多(Zinkgrafetal., 2018)。细胞壁中含有由大量胶质纤维和部分非纤维素、多糖组成的胶质层(G-layer)，并完全取代了正常木材次生壁的S3层甚至是S2层 (Decouetal., 2020; Gritschetal., 2015)，胶质层缺少半纤维素和木质素，使得木材的木质化程度降低(Pilateetal., 2004)。与正常木材相比，应拉木中木质素、半纤维素含量显著降低，纤维素含量较高(Pramodetal., 2013)。而裸子植物形成的应压木特点与双子叶植物的应拉木特点相反，应压木通常在弯曲或倾斜的树干近地侧形成较大的生长环(Groover, 2016)。应压木的次生壁没有S3层，S2层增厚(Donaldsonetal., 1999)。大部分木质素集中在S2层，致使木质素含量增高，而纤维素含量减少。木质素含量的增高使得应压木的木材密度增大并且表现出更强的抗压性(Westing, 1965)。

在本研究中，玉米受到重力作用以后，茎节近地侧发生膨大。从横切面可以看出，近地侧部位的维管束细胞数目增多且呈现为纺锤形，而远地侧维管束的结构、大小和细胞壁厚度因生长状态的不同，与对照相比有不一样的变化。可以推测，玉米在响应重力过程中也会发生类似于裸子植物重力响应的偏心生长，即应力木是在弯曲茎干的近地侧，对立木在远地侧。此外，对照植株维管束鞘的细胞壁增厚，木质素含量较高；而近地侧膨大部位维管束的细胞壁比对照植株维管束细胞壁薄，木质素含量较少，纤维素含量增加。这些特点又与双子叶植物的应拉木相似(Pramodetal., 2013)，都具有纤维素含量高、木质素含量低等特点。综上可以看出，玉米对重力的反应及响应过程可能综合了裸子植物和双子叶植物重力响应的一部分特点，在近地侧形成类似于应力木的结构，但其维管束的木质素含量较低，纤维素含量增高。

玉米没有连续的分生组织结构，玉米茎秆的节和节间在拔苗期已分化形成，节间的伸长主要依靠居间分生组织完成(季青等，2004)。因此，当重力条件改变后，玉米不能像杨树或松树一样依靠自生的形成层系统进行持续的细胞分化和次生生长，发生偏心生长，并通过次生细胞壁结构和成分的改变来产生适应重力条件改变的形态。玉米是通过茎秆的不同茎节来感应重力，从顶端向下依次向上弯起，但并不是所有的节间都会发生形态的变化，比如，本研究中的玉米均处于10叶期，只有在中部靠下的第4、5、6茎节会出现明显的组织膨大。通过显微结构分析，可以看出，虽然没有树木的形成层，重力诱导下玉米居间分生组织活动所产生的维管组织(维管束)在近地侧产生了与应拉木相似的特性变化，其特征变化的部位与裸子植物的压缩木类似，都是在近地侧位置。因此，玉米感应重力响应具有自己的特征，这为研究植物重力响应提供了新的研究材料和途径。在木材形成的研究中，木质部的分化调控研究大都是以拟南芥(Arabidopsisthaliana)突变体作为研究材料，而管状分子分化研究则是利用百日草(Zinniaelegans)叶肉细胞体外培养诱导系统，这些研究成果构建了木材形成的基本基因调控网络。玉米作为单子叶植物，其居间分生组织与双子叶木本植物形成层的分生组织类型显著不同，可用来观察在重力诱导下不同分生组织对维管系统分化(木材形成)的不同影响。试验结果也证明单子叶禾本科分生组织对于重力的反应有其特有的特点，但重力作用下维管组织的分化确实出现了类似杨树应力木的导管少、细胞壁木质素少等特性。通过比较不同分生组织在重力下对维管组织的影响及相应的基因表达，可以为理解维管组织分化(木材形成)的调控机制，为木材形成的研究探索新的研究途径。

此外，有研究通过比较单子叶植物[丝兰(Yucca)和朱蕉(Cordyline)]的形成层及其早期衍生组织与双子叶植物[杨树和桉树(Eucalyptus)]维管形成层和次生木质部组织的转录组数据，发现单子叶形成层和维管形成层的调控存在着广泛的重叠。在表达基因中，单子叶形成层和维管形成层样本中有80%以上的基因本体注释(GO terms)相同(Zinkgrafetal., 2017)。因此单子叶植物重力响应的研究对理解木本植物不同的重力响应机制具有一定的参考价值。此外，玉米重力响应表型变化既包含裸子植物的一部分特征，又具有双子叶木本植物的一部分特征，且其主要变化发生在维管组织，因此对玉米重力响应的研究对于林木木材形成特别是单子叶植物如竹子的竹材遗传调控具有一定的借鉴意义。