外源生长物质对干旱胁迫条件下甜高粱种子萌发的影响

梁 佳， 马依努·吾斯曼， 方志刚,*

(1.喀什大学生命与地理科学学院，新疆 喀什 844000；2.新疆帕米尔高原生物资源与生态重点实验室，新疆 喀什 844000)

全球干旱和半干旱地区面积占总土地面积的35%，我国干旱、半干旱区面积占土地总面积的近50%[1-2]。水分是影响干旱区植物生长、产量及品质形成的首要因素[3-4]，环境中水分缺乏即干旱胁迫首先影响植物种子萌发及幼苗生长[5]。干旱胁迫达到一定阈值时，会显著抑制种子萌发和幼苗生长;严重的情况下，导致作物大幅减产，甚至发生植株死亡的现象[6]。种子引发是一项控制种子缓慢吸水并逐步回干的处理技术，它对许多植物前期的生长有重要作用，可促进种子萌发、提高幼苗抗逆性[7]。用外源生长物质(植物激素和植物生长调节剂)引发种子是一项种子引发技术，广泛应用于农业生产中，如在干旱环境中经褪黑素(melatonin，MT)引发的棉花(GossypiumhirsutumL.)种子和水杨酸(salicylic acid，SA)引发的小冠花(Coronillavaria)种子均可不同程度地提高其发芽率[8-9]。采取种子引发技术，促进干旱环境中的作物种子萌发，对旱区作物幼苗建成、抗逆性提高及产量形成十分重要。

甜高粱(SorghumbicolorL.)，一年生C4植物，抗旱性较强，作青贮饲料平均产量可达82.5 t·hm-2[10]，也可为造纸及制备生物乙醇提供原料，其开发潜力巨大[11]。尽管已有研究表明，外源生长物质引发可调节甜高粱种子的萌发效应，如经亚精胺(spermidine，Spd)引发可以增强甜高粱幼苗的抗旱性[12]。但大多数研究仅停留在单一外源生长物质引发对甜高粱种子萌发的影响，缺乏评价多种外源生长物质引发对甜高粱种子萌发期抗旱效应的比较。本研究以甜高粱品种‘大力士’为材料，探究干旱条件下外源生长物质[褪黑素(MT)、水杨酸(SA)、5-氨基乙酰丙酸盐酸盐(5-aminolevulinic acid hydrochloride，5-ALA)、α-萘乙酸(1-naphthalene acetic acid，NAA)、赤霉素(gibberellin，GA3)、24-表油菜素内酯(epibrassinolide，EBR)和胺鲜酯(diethyl aminoethyl hexanoate，DA-6)]引发处理种子后的萌发效应，筛选促进甜高粱种子萌发最佳的外源生长物质及其浓度配比，以期为旱区种植甜高粱提供可行操作方法、为促进种子萌发提供可选择的外源生长物质，同时为上述外源生长物质缓解甜高粱干旱胁迫的生理机制提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

选用甜高粱品种‘大力士’为材料。褪黑素(MT)、水杨酸(SA)、5-氨基乙酰丙酸盐酸盐(5-ALA)、α-萘乙酸(NAA)、赤霉素(GA3)和24-表油菜素内酯(EBR)，购自北京索莱宝科技有限公司；胺鲜酯(DA-6)，购自上海麦克林生化科技有限公司；聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)购自北京索莱宝科技有限公司。

1.2 试验方法

7种生长物质分别设置5个浓度梯度：0，0.125，0.25，0.5 和1.0 mmol·L-1。干旱胁迫用PEG模拟，根据前期预试验结果，设定浓度为10%。选大小一致的甜高粱种子，用5% NaClO消毒20 min，去离子水洗净后，吸水纸吸干水分。种子分别用上述外源生长物质浸种引发2 h(20℃黑暗)后，用蒸馏水洗净，水分回干后，记录种子原始质量。将处理好的种子分为两组，一组均匀置于铺有两层滤纸的培养皿内(直径9 cm)，每皿25粒种子，每处理3次重复，向培养皿中加入8 mL10% PEG溶液；另有一组用蒸馏水引发2 h后，向其培养皿中加入8 mL蒸馏水作为对照。所有培养皿置于暗处，分别于 0，4，8，12和24 h记录吸水量。待种子萌发后，将其置于植物培养室中继续培养(光周期12 h/12 h，光照强度300 μmol·m-2·s-1，昼夜温度32/25℃)，每天查看处理液，保持培养皿湿润。第3天开始每天统计种子萌发数量，第7天测量其根长、芽长、鲜重及干重。

1.3 种子萌发相关指标测定

种子吸水量、发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数参考朱广龙等[13]的计算方法。为消除其它环境因子对试验产生的误差，并评价7种生长物质调节甜高粱种子萌发的抗旱效应，试验数据均采用标准化处理即指标相对值(处理指标值/对照指标值)进行统计分析。相对吸水量(relative water absorption，RWA)、相对发芽率(relative germination rate，RGR)、相对发芽势(relative germination potential，RGP)、相对发芽指数(relative germination index，RGI)、相对活力指数(relative vitality index，RVI)采用Amooaghaie等[14]和Li等[15]方法计算。根据Fang等[16]方法计算相对根长(relative root length，RRL)、相对芽长(relative bud length，RBL)、相对鲜重(relative fresh weight，RFW)和相对干重(relative dry weight，RDW)。

1.4 不同生长物质引发条件下甜高粱芽苗期抗旱性的综合评价

参考Fang等[16]和段利萍等[17]的方法，用模糊数学中隶属函数法建立综合评价体系，分析种子在萌发期应对干旱胁迫的能力。对同一外源生长物质而言，其不同浓度引发处理种子后，用某一指标相对值的均值反映甜高粱种子萌发的抗旱效应。通过建立综合评价体系，系统地评价外源生长物质引发处理种子后甜高粱在萌发期的抗旱能力。评价体系中有关隶属函数及权重等的计算方法如下：

(1)

(2)

(3)

(4)

(5)

1.5 数据分析

采用Origin 9.0绘图；采用SPSS 20.0进行方差分析；聚类分析判定外源生长物质引发条件下，甜高粱芽苗期抗旱效果的分类。

2 结果与分析

2.1 不同生长物质引发对干旱胁迫下甜高粱种子吸水量的影响

如图1所示，外源生长物质及其浓度极显著影响干旱胁迫下种子吸水量(P<0.01)。随生长物质浓度升高，MT，SA和EBR引发的甜高粱种子RWA先升高后降低。低浓度的5-ALA引发导致种子的RWA达峰值。NAA引发后，种子RWA变化不明显。GA3引发种子后，其RWA随浓度升高逐渐减小。相反，DA-6引发导致种子的RWA逐渐增加。不同引发处理中，当EBR浓度为0.125 mmol·L-1时，RWA最大。

图1 不同浓度外源生长物质对干旱胁迫下甜高粱种子相对吸水量的影响Fig.1 Effects of different concentrations of exogenous growth substances on relative water absorption of sweet sorghum seeds under drought stress注：**表示P<0.01。F1，F2，F3分别代表生长物质、引发浓度和生长物质与浓度交互作用的统计量值。下同Note:**Indicates P<0.01. F1,F2,F3 represents the statistical value of growth substance,priming concentration interaction between growth substance and concentration,respectively. The same as below

2.2 不同生长物质引发对干旱胁迫下甜高粱种子萌发的影响

图2表明，生长物质、浓度及其交互作用均极显著影响种子相对发芽率、相对发芽势、相对发芽指数及相对活力指数(P<0.01)。干旱胁迫下，同一外源生长物质引发后，随其浓度增加，种子相对发芽率、相对发芽势、相对发芽指数及相对活力指数总体均出现先升高后降低的趋势，但其峰值取决于外源生长物质浓度。如低浓度条件下，DA-6引发种子后，其相对发芽率和相对发芽指数最大(图2A，C)。0.5 mmol·L-1的MT引发种子后，种子相对发芽势和相对活力指数最大(图2B，D)。种子经0.25～0.5 mmol·L-1的5-ALA引发后，各项指标均为最小值。NAA浓度为0.125和1 mmol·L-1时，种子的相对发芽率、相对发芽指数及相对活力指数均为最小值(图2B～D)。

图2 不同浓度外源生长物质对干旱胁迫下甜高粱种子相对发芽率、发芽势、发芽指数及相对活力指数的影响Fig.2 Effects of different concentrations of exogenous growth substances on relative germination rate,germination potential,germination index and relative vigor index of sweet sorghum seeds under drought stress

2.3 不同生长物质引发对干旱胁迫下甜高粱幼苗生长的影响

图3表明，生长物质、浓度及二者交互作用均极显著影响干旱胁迫下甜高粱幼苗生长(P<0.01)。随生长物质浓度增加，MT引发的幼苗各项指标均先增加后降低(图3A～D)；经NAA和DA-6引发的种子，幼苗相对干重亦出现相同的趋势(图3D)。然而，用0.25～1.0 mmol·L-1的NAA引发种子则显著抑制了幼苗根长(图3A)。0.125和0.25 mmol·L-1的5-ALA引发种子后，幼苗相对芽长与干旱胁迫相比无明显变化(图3B)。同样，种子经上述两个浓度的5-ALA，NAA和GA3引发后，幼苗相对鲜重亦无明显变化(图3C)。用0.125 mmol·L-1的SA引发种子，幼苗相对根长、相对鲜重及相对干重均最大(图3A，C和D)。但经0.25～1.0 mmol·L-1NAA引发种子，幼苗相对根长及相对芽长均最小(图3A～B)。MT浓度为0.25和0.5 mmol·L-1时，幼苗相对根长、相对芽长和相对鲜重值均最大(图3A，C)。

2.4 不同生长物质引发下甜高粱种子萌发期抗旱效应

D值代表生长物质及浓度配比下甜高粱种子萌发的抗旱效应。由表1可知，相对吸水量(RWA)、相对活力指数(RVI)、相对根长(RRL)和相对芽长(RBL)的权重系数之和超过50%。MT(0.5 mmol·L-1)引发处理的综合得分值最高，各处理综合得分大小顺序如下：MT(0.5)>SA(0.125)>MT(0.25)>GA3(0.125>EBR(0.125)>MT(1.0)>DA-6(0.125)>EBR(0.25)>SA(0.25)>MT(0.125)>GA3(0.25)>SA(0.5)>GA3(0.5)>SA(1.0)>5-ALA(0.125)>EBR(0.5)>DA-6(0.5)>EBR(1.0)>5-ALA(1.0)>DA-6(0.25)>5-ALA(0.25)>NAA(0.5)>5-ALA(0.5)>10%PEG>NAA(0.25)>GA3(1.0)>NAA(0.125)>DA-6(1.0)>NAA(1.0)(括号中数字后省略了浓度单位mmol·L-1，下同)。

图3 不同浓度外源生长物质对干旱胁迫下甜高粱幼苗相对根长、芽长、鲜重及干重的影响Fig.3 Effects of different concentrations of exogenous growth substances on relative root length,shoot length,fresh weight and dry weight of sweet sorghum seedlings under drought stress

表1 干旱胁迫下不同浓度生长物质处理甜高粱的各测定指标的隶属函数值Table 1 Subordinate function values of determination indexes of sweet sorghum treated with different concentrations of growth substances under drought stress

续表1

2.5 不同浓度生长物质对缓解甜高粱干旱胁迫的聚类分析

基于综合得分D值的聚类分析见图4，当欧氏距离为5时，29个引发处理可分为5类。第1类引发处理是MT(0.5)，D值为0.926。0.561≤D≤0.725为第2类，有MT(0.25)和SA(0.125)两个引发处理。0.464≤D≤0.619为第3类，包括5-ALA(0.125)，EBR(0.5)，DA-6(0.5)，SA(1.0)，GA3(0.5)，SA(0.5)，MT(1.0)，EBR(0.125)，MT(0.125)，GA3(0.25)，EBR(0.25)，DA-6(0.125)，SA(0.25)和GA3(0.125) 共14个引发处理。0.286≤D≤0.416为第4类，有10%PEG，NAA(0.5)，NAA(0.125)，DA-6(1.0)，NAA(0.25)，GA3(1.0)，5-ALA(0.5)，5-ALA(1.0)，EBR(1.0)，5-ALA(0.25)和DA-6(0.25) 共11个引发处理。D值为0.102为第5类，仅有NAA(1.0)1个引发处理。

图4 基于综合评价D值的聚类分析谱系图Fig.4 Cluster analysis pedigree based on D value of comprehensive evaluation注：图中数字1～29表示引发处理的综合得分D值排名Note:The numbers 1～29 in the figure indicate the D-value ranking of the comprehensive score of priming treatments

3 讨论

3.1 外源生长物质引发对干旱胁迫下甜高粱种子吸水量、萌发能力及幼苗生长的影响

种子吸水萌发及幼苗建成是植物顺利完成生活史的关键时期，容易受到环境因子及化学信号调控[18]。环境中水分亏缺即干旱胁迫可导致种子萌发、幼苗生长受到抑制[19]，其外部形态指标主要包括发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数、幼苗根长及干物质质量等[20]。采用PEG模拟干旱胁迫，并结合种子引发技术，探讨种子在干旱胁迫下的萌发效应，具有周期短、便于操作，适合大量材料开展的优势，具有一定的科学性[21]。本试验中，10% PEG处理下，甜高粱种子发芽率约为对照的87%(图1～3)，同样用10% PEG模拟干旱胁迫处理的玉米(ZeamaysL.)种子发芽率约为对照的74%[22]，表明甜高粱可能更适宜在旱区种植。

许多研究表明，种子发芽及苗期的形态学指标(吸水量、发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数及根长)既可用于表征植物抗旱性，也可用于评价外源生长物质对植物抗旱能力的调节作用[23]。在旱区的农业生产中，用植物激素及生长调节剂引发种子，可通过调节种子萌发效应和幼苗群体建成以应对干旱环境[24]。本研究发现，在相同浓度条件下，不同生长物质引发处理后，种子萌发的单项指标存在较大差异。例如，当SA引发浓度为0.125 mmol·L-1时，甜高粱种子根长约为对照的88%，用同等浓度的DA-6引发处理的根长约为对照41%(图3A)；MT为0.5 mmol·L-1引发处理种子后，甜高粱芽长达到峰值，约为对照的91%，而NAA引发处理芽长为最小值，仅为对照44%(图3B)，这与干旱胁迫条件下，赤霉素(GA3)、吲哚乙酸(indole-3-acetic acid)、6-苄基氨基嘌呤(6-BA)引发处理玉米(ZeamaysL.)种子的研究结果相似[25]，均表现出外源生长物质对种子萌发及幼苗生长的浓度效应。另一方面，用同一生长物质，其不同浓度引发处理对种子萌发的影响也存在差异。本研究中，甜高粱种子随MT浓度增加，所有指标表现出先增加后降低的趋势(图1-3)；经0.125 mmol·L-1的GA3引发处理，甜高粱种子吸水量约为对照的87%，当GA3浓度为1.0 mmol·L-1时，种子吸水量约为对照的51%(图1)，在水杨酸(SA)引发处理小冠花(Coronillavaria)种子萌发期抗旱胁迫的研究中，也得到类似的结果[20]。此外，本试验还发现，经EBR处理后，甜高粱种子的相对发芽指数及相对根长与干旱胁迫处理相比均无明显变化，但相对活力指数较10% PEG处理明显提高，这有可能和种子的引发时间有关。齿缘吊钟花(Enkianthusserrulatus)种子经赤霉素(GA3)引发6 h和24 h，其种子发芽率、发芽势也出现明显差异[26]。上述研究结果说明生长物质对种子萌发还存在时间效应。综合来看，外源生长物质引发对植物萌发既有正向作用的调节，也有负向作用调节，只有适宜的生长物质及浓度配比，才可有效的提高植物抗旱胁迫能力[27]。

3.2 评价甜高粱种子萌发期抗旱效应的方法

本试验条件下，甜高粱种子在相同浓度下，经不同外源生长物质引发处理，其萌发及幼苗生长均表现出较大差异。此外，对同一萌发指标而言，不同生长物质间亦存在较大差异。因此，用单个指标确定某一种外源生长物质提高甜高粱在芽苗期的抗旱性具有片面性。相反，用隶属函数建立的综合评价体系可以同时评价多个指标，减少单个参数带来的误差[28-29]。基于此，本研究根据综合评价体系，用综合得分值量化了不同生长物质及浓度配比引发种子后甜高粱在芽苗期应对干旱胁迫的效应。试验结果表明相对吸水量(RWA)、相对活力指数(RVI)、相对根长(RRL)和相对芽长(RBL)的权重之和超过50%，说明上述4个指标在本试验的评价体系中占主导地位。胡丁雪等采用综合评价法，认为相对发芽率、相对根长、相对鲜重和相对发芽势可作为评价甘蓝型油菜(BrassicanapusL)在萌发期耐盐胁迫的主要指标[30]。该结果与本试验不同，这可能与试验处理、指标数量及种子遗传特性等有关。

3.3 外源生长物质引发对甜高粱萌发期抗旱效应的影响

利用聚类分析对本研究的29个处理进行分类，第4类引发处理综合得分值为0.102～0.416，其中包括得分0.320的干旱胁迫处理，这类处理对提高种子萌发抗旱效果不大。第1，2类MT(0.5 mmol·L-1)和MT(0.25 mmol·L-1)，SA(0.125 mmol·L-1)引发甜高粱种子，可提高干旱胁迫下种子萌发和幼苗生长能力，其中MT(0.5 mmol·L-1)引发效果最优，具体表现为种子萌发率没有受抑制，种子相对发芽势、相对发芽指数、相对活力指数均为最大值(图2B-D)。结合旱区农业生产水分不足这一现状，本试验推荐0.5 mmol·L-1的MT引发甜高粱种子，有助于提高甜高粱在芽苗期的抗旱能力及幼苗群体形态建成。

4 结论

本研究结果表明，外源生长物质及其浓度均极显著影响干旱胁迫下甜高粱种子萌发及幼苗生长。适宜浓度的生长物质引发种子可提高甜高粱在芽苗期的抗旱效应。利用隶属函数建立综合评价体系，确定了甜高粱种子经外源生长物质引发后，其萌发期的抗旱效应。其中MT，SA，GA3，EBR和DA-6在适当浓度引发种子后，均能有效促进种子萌发和幼苗生长，而MT(0.5 mmol·L-1)引发种子后的效果最佳。本试验得到的评价体系，为筛选促进植物种子萌发的外源生长物质提供了是一种快速、有效的方法。