Caspase-1抑制剂在大鼠脊髓损伤后的靶点作用

锁志刚，丁惠强，费 乐，黑 龙，戈朝晖，马宗军，陈霄雷

（宁夏医科大学总医院脊柱骨科，银川 750004）

脊髓损伤可分为原发性损伤和继发性损伤。继发性损伤是可逆的，在脊髓损伤的治疗中占主导作用。研究证实[1]，Caspase-1抑制剂是Caspase-1不可逆和可渗透细胞的特异抑制剂。本研究采用改良的Allen's重物打击法建立大鼠脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）模型，通过HE染色、免疫组织化学法检测观察Caspase-1抑制剂在SCI后对大鼠Caspase-1、白细胞介素（IL）-1β和IL-18表达的抑制作用，以期为继发性脊髓损害后靶点抑制作用提供新的实验基础。

1 资料与方法

1.1 实验动物与分组

成年雄性SD大鼠72只（由宁夏医科大学实验动物中心提供），体质量250～300 g，随机分为对照组、SCI组、AC.YVAD.CMK组、甲基强的松龙（methyl prednisolone，MP）组，每组18只，SCI组、AC.YVAD.CMK组及MP组大鼠均应用改良的Allen's重物打击法建立大鼠脊髓损伤模型，正常对照组大鼠只做全椎板切除。4组大鼠依据损伤后取材时间（分别于术后24 h、72 h、7 d处死）再各分3个亚组，每个亚组6只。

1.2 主要试剂

Caspase-1抑制剂：AC.YVAD.CMK购自MC公司；二氨基联苯胺（DAB）显色试剂盒购自Tiangen公司；甲基强的松龙购自PfizerMamu facturingBelgiumNV公司；兔抗大鼠Caspase-1多克隆抗体、兔抗大鼠IL-l8多克隆抗体、IL-1β多克隆抗体、过氧化物酶标记的链霉卵白素染色试剂盒均购自北京博奥森生物技术有限公司。

1.3 大鼠脊髓损伤模型制作及各组给药

大鼠实验前常规禁食8 h，实验顺序随机。选用30 g·L-1的戊巴比妥钠（40 mg·kg-1）腹腔注射麻醉，麻醉成功后，将大鼠固定于手术台，常规背部剃毛、消毒铺巾。无菌条件下取腰背部正中切口，逐层分开显露T8～T10椎板，行T9全椎板切除，显露硬脊膜并使之保持完整，钳夹固定T8及T10棘突，用直径2.5 mm、质量10.0 g的不锈钢棒沿带有刻度的玻璃导管从25 mm高处垂直下落，打击在由塑料材料制成的底部呈凹面、直径为3 mm的撞杆上，造成大鼠脊髓不完全损伤致伤后迅速移开打击物，0号线逐层缝合切口。

模型成功的判定标准：打击后，损伤处脊髓出血、水肿，大鼠出现摆尾反射，双下肢及躯体回缩样扑动，麻醉清醒后双下肢呈弛缓性瘫痪。造模成功后，AC.YVAD.CMK组大鼠经腹腔内开始给药，药物为AC.YVAD.CMK，浓度为0.3 mg/100 g，早晚各1次，连续3 d，MP组大鼠经腹腔内开始给药，药物为甲基强的松龙，浓度为30 mg·kg-1，早晚各1次，连续3 d，SCI组及对照组大鼠依据术中出血量的多少即刻腹腔内注射等量的5%葡萄糖盐水，以补充血容量。所有大鼠均给予青霉素钠盐500000 IU背外侧肌群肌注预防感染，每天1次，持续3 d。大鼠注意保温，分笼饲养，自由取食。每天早8：00及晚8：00行膀胱按摩协助排尿，直至建立反射性排空。

1.4 取材、切片制备

分别于术后24 h、72 h、7 d取各组大鼠6只，将大鼠过量麻醉，经左心室-升主动脉插管，快速灌注冰生理盐水（4℃）冲洗，待流出的液体清亮后，灌注4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液固定45 min，自背部原切口显露脊髓，以损伤处为中心，切取长约2.0 cm脊髓组织，放入4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液12～24 h，然后手工脱水，石蜡包埋（冠状面切成长约3 mm的多个节段包埋于同一蜡块中），行冠状面连续切片，每个组织块连续切片8张，片厚4μm。

1.5 HE染色及Caspase-1、IL-1β及IL-18免疫组化染色

每个时间点每只大鼠随机选取2张切片进行HE染色，以损伤严重段脊髓取视野，光镜下观察脊髓组织形态学变化。每个时间点每只大鼠随机选取2张切片分别进行Caspase-1、IL-1β及IL-18免疫组化染色。免疫组化染色按试剂盒说明书操作，一抗Caspase-1的工作浓度为1∶300，一抗IL-1β的工作浓度为1∶200，一抗IL-18的工作浓度为1∶500，最后用DAB显色，镜下观察显色背景，蒸馏水清洗终止显色，苏木素轻度复染，梯度脱水，透明，中性树胶封片。以PBS代替一抗作为阴性对照。细胞内出现棕黄色颗粒为染色阳性细胞，每例切片双盲法计数，在400倍镜下，随机观察计数6个视野，记录阳性细胞数，阳性表达率=6个视野内阳性细胞总数/6个视野内细胞总数×100%。

1.6 统计学方法

数据采用SPSS 22.0软件进行统计分析，三组大鼠脊髓组织中Caspase-1、IL-1β及IL-18阳性表达率的比较采用行×列表的卡方检验，P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠脊髓损伤组织形态学变化

对照组HE染色大鼠神经元细胞结构形态规则，白质致密。AC.YVAD.CMK组大鼠24 h时镜下主要表现为损伤局部可见出血灶，神经元细胞肿胀，但大多数细胞结构完整，可见少量神经元细胞结构变形死亡，周围可见少量炎性细胞，以中性粒细胞为主；72 h时主要表现为出血灶大部分吸收，损伤周围可见大量炎性细胞浸润，以中性粒细胞为主，神经元细胞结构变形坏死较24 h明显，灰质结构破坏，细胞空泡变性坏死，出现大量神经元细胞死亡。存活的神经元细胞中部分可见细胞膜破裂及核固缩；7 d时神经元细胞数量较前明显减少，可见胶质细胞增生，炎性细胞也较前明显减少，并出现少量淋巴细胞浸润。

2.2 大鼠脊髓组织中Caspase-1表达情况

Caspase-1阳性表达定位于细胞胞浆，染色后为棕黄色颗粒。对照组有少量阳性细胞表达，AC.YVAD.CMK组24 h时Caspase-1阳性表达较SCI组少（图1A），72 h时Caspase-1阳性细胞减少，损伤周围可见大量炎性细胞（图1B），7 d时有少量Caspase-1阳性细胞表达（图1C）。

在脊髓损伤后24 h、72 h和7 d时，SCI组Caspase-1阳性表达率均高于对照组，AC.YVAD.CMK组Caspase-1阳性表达率均低于SCI组（P均＜0.01）。24 h和72 h时，AC.YVAD.CMK组Caspase-1阳性表达率低于MP组（P＜0.01），见表1。

表1 各组大鼠脊髓组织中Caspase-1阳性表达率比较（%）

图1 各组大鼠脊髓组织中Caspase-1、IL-1β和IL-18的阳性表达情况（免疫组化×400）

2.3 大鼠脊髓组织中IL-1β的表达情况

IL-1β阳性表达定位于胞浆，染色后为棕黄色颗粒。对照组大鼠脊髓组织中有少量细胞表达阳性；MP组24 h时，镜下可见IL-1β阳性细胞少于AC.YVAD.CMK组（图1D）；72 h、7 d时，IL-1β阳性细胞数明显减少（图1E、图1F）。

在脊髓损伤后24 h、72 h和7 d时，SCI组IL-1β阳性表达率均高于对照组，AC.YVAD.CMK组和MP组IL-1β阳性表达率均低于SCI组（P均＜0.01）；24 h和72 h时，MP组IL-1β阳性表达率均低于AC.YVAD.CMK组（P均＜0.01），见表2。

2.4 大鼠脊髓组织中IL-18的表达情况

IL-18阳性表达定位于细胞胞浆，染色后呈棕黄色颗粒。对照组大鼠脊髓组织中有少量细胞表达阳性；SCI组24 h时镜下IL-18阳性细胞数较对照组多（图1H）；72 h时IL-18阳性细胞的表达达到峰值，损伤周围可见大量炎性细胞（图1I）；7 d时SCI组IL-18阳性细胞数明显减少仍较对照组多（图1J）。

在脊髓损伤后24 h、72 h和7 d时，SCI组IL-18阳性表达率均高于对照组，AC.YVAD.CM组和MP组IL-18阳性表达率均低于SCI组（均＜0.01），24 h和72 h时，AC.YVAD.CMK组IL 18阳性表达率低于MP组（P均＜0.05），见表3。

表2 各组大鼠脊髓组织中IL-1β阳性表达率比较（%）

3 讨论

脊髓损伤是多因素参与的复杂过程，其病理机制仍不完全明确。研究表明[2]，损伤后炎性反应在脊髓损伤中起重要的作用，可导致细胞的坏死及凋亡，从而加重神经功能。Caspase-1又称IL 1β转化酶（interleukin-1betacoveratingenzymeICE）[3]，是Caspase超家族的重要成员，被认为主要参与机体的炎性反应，在组织损伤过程中催化生成有活性的细胞因子IL-1β和IL-18，有促炎性反应及级联放大效应。已有研究[4]证实Caspase-1、IL-1β及IL-18在脊髓损伤后表达增高，参与脊髓损伤后炎性反应。

表3 各组大鼠脊髓组织中IL-18阳性表达率比较（%）

研究证实[5-6]，MP在脊髓损伤治疗中发挥重要的作用，其主要作用包括抑制炎性反应，能够抑制炎症和炎性物质释放，对脊髓损伤后神经功能恢复有促进作用，是目前临床上治疗脊髓损伤的首选药物。研究发现[7]，脊髓损伤早期使用高剂量MP冲击疗法治疗脊髓损伤是有效的。黄星球等[8]研究表明，大剂量MP冲击治疗可明显改善微环境，通过对神经元细胞内尼氏体染色，证实MP可改善脊髓损伤后神经元形态，促进神经元恢复。本研究结果表明，大剂量MP组炎性细胞相对减少，神经元细胞结构与SCI组、AC.YVAD.CMK组无明显差别。对于大剂量MP在脊髓损伤后抑制炎性反应的分子机制尚不完全清楚。本实验研究也证实在脊髓损伤后给予大剂量MP治疗，可抑制损伤后Caspase-1、IL-1β及IL-18的表达，特别是IL-1β的阳性表达。临床上大剂量使用MP的并发症有加重感染、诱发消化道出血及穿孔、导致股骨头坏死等。如何减少相关并发症的发生，是否能减少MP的使用量或者使用时间以及有无替代治疗方法，是目前临床关注的主要问题。

Caspase-1抑制剂可直接抑制Caspase-1的活性，阻碍其介导炎性反应的分子信号通路。关于Caspase-1抑制剂的研究多集中在中枢神经系统脑损伤方面[9-10]。研究发现[11]，Caspase-1抑制剂在脑损伤及脑脓肿动物模型中有显著疗效，能减轻脑水肿，对脑缺血后神经元具有保护及促进修复作用，还能促进炎性反应的进展。本研究表明，AC.YVAD.CMK组在HE染色光镜下可见，损伤脊髓组织中炎性细胞的阳性细胞表达相对减少，提示Caspase-1抑制剂可以减轻脊髓损伤后炎性反应，减轻组织水肿。应用AC.YVAD.CMK后可减轻缺血组织的损伤程度，抑制神经元凋亡，改善神经功能，减轻脑水肿，推测AC.YVAD.CMK是通过抑制IL-1β而减轻脑水肿[12]。本研究表明，在应用AC.YVAD.CMK后，Caspase-1的阳性表达较MP组及SCI组降低，提示Caspase-1抑制剂在脊髓损伤后对Caspase-1有特异性抑制作用。AC.YVAD.CMK组及MP组IL-1β及IL-18的阳性表达均低于SCI组，提示Caspase-1抑制剂可以有效抑制细胞因子IL-1β和IL-18的表达，也进一步证实IL-1β和IL-18是Caspase-1特异有效的蛋白酶。在组织损伤过程中，通过催化生成有活性的细胞因子IL-1β和IL-18，是导致炎症进一步发挥致炎促损伤的原因。损伤后7 d，AC.YVAD.CMK及MP组的Caspase-1、IL-1和IL-18与对照组比较差异均无统计学意义，提示Caspase-1抑制剂阻断了炎性反应的进程，减轻了脊髓损伤组织水肿，为促进神经功能恢复提供了微环境。

综上，Caspase-1抑制剂及MP均可以减轻损伤后脊髓组织中炎性细胞的表达，降低脊髓损伤后Caspase-1、IL-1β及IL-18的阳性表达。Caspase-1抑制剂可能对SCI后的继发性损伤有一定的靶向抑制作用，可促进脊髓损伤后神经功能恢复。