细胞分裂周期相关蛋白5在肝细胞肝癌中的表达及临床意义△

李德新，李飞，赵晓晨，李华，李茂德，兰戴天，安祥

四川省医学科学院·四川省人民医院（东院）肝胆胰腺外科，成都 610010

肝细胞肝癌是最常见的消化系统恶性肿瘤之一，病情严重、发展迅速，病死率极高。早期肝细胞肝癌患者往往缺乏特异性的临床症状，就诊时已处于中晚期，临床预后较差。目前，早期肝细胞肝癌患者主要采取根治性手术治疗，中晚期或复发转移性干细胞肝癌患者主要采用全身治疗（如靶向治疗）+局部治疗（手术、消融、放疗、经导管动脉栓塞化疗等），但治疗效果并不理想。探讨肝细胞癌的形成机制，寻找关键的治疗靶点，对肝细胞肝癌的治疗有重要意义。细胞分裂周期相关蛋白 5（cell division cycle associated 5，CDCA5）基因属于肝癌数量性状位点（quantitative trait locus，QTL）热点区域基因，其相对表达量及在细胞的定位随细胞周期不同而变化，能够调节细胞周期相关蛋白和转录因子的表达，参与细胞增殖分化。研究显示，CDCA5在多种肿瘤组织中高表达，可以与细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase，ERK）共同作用，调控肿瘤细胞的增殖。细胞周期蛋白依赖性激酶1（cyclin dependent kinase 1，CDK1）、细胞周期蛋白 B1（cyclin B1）是调节细胞周期的相关蛋白，其复合物有丝分裂促进因子在细胞周期G/M期中发挥重要作用，不同的CDK-周期蛋白质复合物可促进特异性的靶蛋白质磷酸化而激发细胞周期各期的顺利进行，CDK通过调节靶蛋白磷酸化而调控细胞周期的运转。因此，本研究通过检测CDCA5和ERK在肝细胞肝癌组织中的表达，分析其作用机制，旨在明确CDCA5在肝细胞肝癌治疗中的应用价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2018年1月至2019年1月四川省人民医院肝胆外科收治的原发性肝细胞肝癌患者。纳入标准：手术病理学检查确诊为肝细胞肝癌；术前均未接受过放化疗治疗；临床资料及随访资料完整。排除标准：合并转移性肝癌或其他恶性肿瘤；合并急性严重感染、明显肝肾功能不全；合并血液系统疾病或自身免疫系统疾病；无法耐受手术治疗。依据纳入和排除标准，本研究共纳入260例肝细胞肝癌患者，其中男174例，女86例；年龄25～75岁，平均（51.34±11.25）岁；肿瘤直径≤5 cm 121例，＞5 cm 139例；Edmondson分级：Ⅰ级41例，Ⅱ级83例，Ⅲ级72例，Ⅳ级64例；巴塞罗那临床肝癌（Barcelona clinic liver cancer，BCLC）分期：0期47例，A期80例，B期77例，C期56例；合并门静脉癌栓118例，未合并门静脉癌栓142例；甲胎蛋白（α-fetal protein，AFP）水平：≥400 ng/ml 164例，＜400 ng/ml 96例。同期选取52例肝脏良性病变患者作为对照，其中男35例，女17例；年龄26～75岁，平均（51.62±11.18）岁。两组患者性别、年龄比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。取肝细胞肝癌患者的肝癌组织和肝脏良性病变患者的正常肝组织。

1.2 实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（reverse transcription- polymerase chain reaction，RTPCR）测定CDCA5、ERK mRNA的相对表达量

取肝细胞肝癌患者的肝癌组织和肝脏良性病变患者的正常肝组织，采用实时荧光定量RT-PCR测定CDCA5、ERK mRNA在肝细胞肝癌组织中的相对表达量，匀浆后，Trizol法提取组织总RNA，总RNA经反转录合成cDNA，进行实时RT-PCR，以GAPDH作为内参。

1.3 蛋白质印迹法（Western blot）检测CDCA5、ERK、CDK1、cyclin B1蛋白的相对表达量

无菌取肝细胞肝癌组织或正常肝组织约50 mg，研磨提取总蛋白，采用Bradford法进行蛋白质定量，将提取的总蛋白（50 μg）样品经过聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，加入5%脱脂牛奶封闭后，加入CDCA5、ERK、CDK1、cyclin B1抗体，4 ℃孵育过夜后加入二抗，37℃孵育2 h，电化学发光（electrochemiluminescence，ECL）检测，以β-actin为内参，采用Photoshop图像分析软件分析蛋白条带灰度值。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 CDCA5、ERK mRNA相对表达量的比较

肝细胞肝癌组织中CDCA5、ERK mRNA的相对表达量分别为（0.81±0.10）、（0.92±0.07），均高于正常肝组织的（0.63±0.03）、（0.54±0.11），差异均有统计学意义（t=2.210、3.652，P＜0.05）。

2.2 CDCA5、ERK、CDK1和cyclin B1蛋白相对表达量的比较

肝细胞肝癌组织中CDCA5、ERK、CDK1和cyclin B1蛋白的相对表达量均高于正常肝组织，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（表1）

表1 不同组织中CDCA5、ERK、CDK1和cyclin B1蛋白相对表达量的比较（±s）

2.3 不同临床特征肝细胞肝癌患者肝细胞肝癌组织中CDCA5和ERK mRNA相对表达量的比较

不同年龄、性别肝细胞肝癌患者肝细胞肝癌组织中CDCA5、ERK mRNA的相对表达量比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。不同肿瘤直径、Edmondson分级、BCLC分期、合并门静脉癌栓情况和AFP水平肝细胞肝癌患者肝细胞肝癌组织中CDCA5、ERK mRNA的相对表达量比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（表2）

表2 不同临床特征肝细胞肝癌患者肝细胞肝癌组织中CDCA5和ERK mRNA的相对表达量（n=260）

2.4 CDCA5和ERK的表达与肝细胞肝癌患者临床特征的相关性

CDCA5、ERK的表达与Edmondson分级为Ⅲ～Ⅳ级、BCLC分期为B～C期、有门静脉癌栓和AFP水平升高呈正相关（P＜0.05）。（表3）

表3 CDCA5和ERK的表达与肝细胞肝癌患者临床特征的相关性

3 讨论

原发性肝细胞肝癌是中国常见的恶性肿瘤之一，病因和发病机制尚未明确，临床主要采取手术治疗，但术后复发率较高，预后较差。本研究结果显示，CDCA5和ERK在肝细胞肝癌组织中的相对表达量较高，表明CDCA5和ERK的异常高表达可能与肝细胞肝癌的发病有关。ERK包括ERK1和ERK2，磷酸化的ERK1/ERK2可以将信号从表面受体传导至细胞核，启动下游靶基因的转录，参与调控细胞骨架的构建、细胞增殖、分化、凋亡及细胞癌变等多种生物学行为。CDCA5可以通过促进姐妹染色单体在细胞周期S期和G/M期稳定结合介导DNA的重组修复，还可以保证姐妹染色单体在有丝分裂后期准确分离，参与了细胞分裂、增殖及凋亡的整个过程。Tokuzen等的研究发现，CDCA5包含ERK和CDK1/cyclin B1的磷酸化位点，其中ERK2磷酸化CDCA的5位点为S79和S209，CDK1/cyclin B1磷酸化CDCA5的位点为S21、S75 和 T159。陈墅圳等研究发现，CDCA5可能依赖ERK的磷酸化来发挥促癌作用，ERK在传导细胞外信号的过程中，进入细胞核，磷酸化CDCA5通过调节细胞周期相关蛋白，调节细胞增殖过程。Shen等的研究发现，CDCA5在肝癌组织中高表达，且CDCA5基因沉默会抑制CDK1和cyclin B1的表达，抑制细胞增殖。本研究结果显示，肝细胞肝癌组织中CDK1、cyclin B1的相对表达量均明显上调，与上述研究一致，CDK1和cyclin B1是细胞周期的相关调节蛋白，其复合物有丝分裂促进因子在细胞周期向G/M期进展中发挥重要作用，表明CDCA5可能通过促进CDK1、cyclin B1的表达，促进细胞周期向G/M期转变，促进有丝分裂，促进肿瘤细胞恶性增殖，有望作为肝细胞肝癌临床治疗的新靶点。

目前，临床缺乏有效的治疗手段来治疗肝细胞肝癌，寻找新的治疗靶点、正确评估患者的病情，有助于延长患者的无病生存期。临床根据肿瘤直径、Edmondson分级、BCLC分期及门静脉癌栓等评估病情严重程度。本研究结果显示，CDCA5、ERK的表达与Edmondson分级为Ⅲ～Ⅳ级、BCLC分期为B～C期、有门静脉癌栓和AFP水平升高呈正相关（P＜0.05）。黄维甄等的研究显示，病理分级、BCLC分期及门静脉栓情况与肝细胞肝癌患者的预后密切相关，病理分级为Ⅲ～Ⅳ级或BCLC分期为B～C期、合并门静脉癌栓或AFP水平升高患者的生存期明显缩短、生存率明显下降，与本研究结果一致。表明CDCA5的表达与肝细胞肝癌患者的病情发展相关，可以反映其病情严重程度，临床可根据CDCA5的相对表达量来评估疾病恶性程度，调整治疗方案，可提高患者的预后。

综上所述，CDCA5和ERK在肝细胞肝癌组织中的表达明显上调，其表达与Edmondson分级为Ⅲ～Ⅳ级、BCLC分期为B～C期、有门静脉癌栓和AFP水平升高呈正相关，CDCA5可能依赖ERK的磷酸化来促进CDK1、cyclin B1的表达，促进细胞周期向G/M期转变，促进细胞有丝分裂，促进肿瘤细胞恶性增殖。但CDCA5和ERK作用于肝细胞肝癌的具体机制尚有待进一步研究。但本研究纳入的样本量较少，可能会对结果产生一定误差，但本研究为临床肝细胞肝癌的治疗提供了新的思路。