柚皮苷对破骨细胞凋亡的影响△

李风波，孙晓雷，马剑雄，马信龙

（天津市天津医院骨科，天津300211）

随着社会老龄化进展，骨质疏松已经成为常见的老年疾病，人群数量逐渐上升［1］。正常人骨重塑靠破骨细胞发挥骨吸收功能，以及成骨细胞发挥骨形成，两者之间相互平衡、相互制约［2］。骨质疏松症病人骨重塑过程中骨吸收大于骨形成，从而造成骨量丢失［3］。目前治疗骨质疏松的药物多数有较大副作用［4］，因此，研究者越来越看重天然药物的开发。国内外研究报道柚皮苷药理作用广泛，能够促进成骨细胞的分化、增殖［5～7］。但尚未有报道柚皮苷对破骨细胞凋亡及其机制的研究。因此，本研究探讨了柚皮苷对破骨细胞凋亡的作用，进一步揭示该药物的作用机制。

1 资料与方法

1.1 薄骨片的制备

牛股骨干粗切获取皮质骨，进一步采用锯片沿股骨纵轴切成厚度约为100 μm骨片，对骨片采用细砂纸进行打磨平滑，裁剪骨薄片（大小约为0.5 cm×0.5 cm），75%酒精浸泡30 min消毒后，采用无菌D-hank's液清洗三遍，置于培养基中4℃备用，取出晾干薄骨片表面液体后使用。

1.2 破骨细胞诱导

将由中国协和医科大学基础医学细胞中心提供的RAW264.7细胞株，分别接种于6孔板中预置的无菌玻片或上述方法制备的薄骨片之上，接种密度2×104/cm2，2 h待细胞贴壁后，更换成高糖DMEM破骨细胞诱导培养基，内含10% FBS和100 ng/ml RANKL，37℃、5% CO2的培养箱中进行诱导培养，2天换一次破骨细胞诱导培养液。

1.3 柚皮苷处理

配制含柚皮苷 0 μg/ml（空白对照）、2 μg/ml、20 μg/ml和200 μg/ml的DMEM培养液。于破骨细胞诱导培养5 d后，更换为上述不同柚皮苷含量的DMEM培养液，在37℃、5% CO2的培养箱继续培养3 d。两天更换一次柚皮苷DMEM培养液。之后收集玻片、骨薄片和细胞进行以下检测。

1.4 检测指标与方法

1.4.1 TRAP染色

将培养板中的玻片取出，按照试剂盒操作方法对诱导后的破骨细胞进行TRAP特异性染色，染色完成后封固进行光镜观察。计数标准：（1）显微镜在100倍视野下，不重复情况下随机选取10个视野计数；（2）成熟破骨细胞浆经TRAP染色后为玫瑰红或粉红色，细胞核数目≥3个。

1.4.2 骨吸收陷窝

将培养板中的薄骨片取出，采用EDTA和胰蛋白酶将破骨细胞从骨薄片上消化，使破骨细胞从骨薄片上脱落，采用2.5%的戊二醛对骨薄片固定半小时，超声清洗3次，每次5 min；之后采用不同浓度乙醇进行梯度脱水（乙醇浓度依次为30%、50%、60%、70%、80%、90%、100%），醋酸异戊酯置换乙醇后，对骨薄片进行CO2临界点干燥，喷金后采用扫描电镜观察。每个骨薄片随机选取10个不重复的区域，采用Image Pro Plus 6.0图像分析软件对骨吸收面积进行分析。

1.4.3 细胞凋亡检测

将细胞消化收集，离心1 500 rpm/min，5 min。离心后培养液和PBS分别对细胞进行洗涤一次；计数后，以1×106/ml细胞密度重悬细胞于结合缓冲液。取100 μl细胞加入 2 μl Annexin V-FITC 和 10 μl碘化丙啶（propidium iodide,PI）。根据不同配置分成三组：（1）不加 Annexin VFITC也不加 PI；（2）加Annexin V-FITC不加 PI； （3）加 PI不加 Annexin V-FITC。混匀后室温下黑暗中反应15 min，补加400 μl结合缓冲液，放入流式细胞仪中检测凋亡结果。

1.4.4 荧光定量PCR检测相关基因表达

细胞消化、收集，加入1 ml TRIzol溶液，振荡混匀。采用相分离技术抽提取RNA，琼脂糖电泳法检测基因浓度及完整性。各组检测基因反转录为cD⁃NA，以GAPDH为内参基因，引物由广州复能基因有限公司设计。基因引物序列：GAPDH正向引物正向引物5'-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3'，反向引物5'-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3'，扩增片段为96 bp；BCL-2正向引物5'-ACGGGGT⁃GAACTGGGGGAGG-3'反向引物 5'-GCATGCT⁃GGGGCCGTACAGT-3'，BAX正向引物 5'-GATG⁃GACGGGTCCGGAGA-3'反向引物 5'-CTCAGCCC ATCTTCTTCCAG-3'Caspase-3：正向引物5'-TTCA⁃GA GGGGATCGTTGTAGAAGTC-3'，反向引物 5'-CAAGCTTGTCGGCATACTGTTTCAG-3'； MMP-9 正向引物5'-ACGACATAGACGGCATCCA-3'，反向引物5'-GCTGTG GTTCAGTTGTGGTG-3'；逆转录反应体系、PCR扩增体系以及反应条件按照试剂盒说明书设定。反应完成后进行扩增曲线和熔解曲线分析。基因表达量以检测基因的初始模板量以2−△△Ct表示。

1.5 统计学方法

采用SPSS 16.0软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差表示，采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法，柚皮苷浓度与各检测值行Pearson相关分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 TRAP染色

TRAP染色及阳性细胞计数见图1。与空白对照组比较，2 μg/ml和 20 μg/ml柚皮苷组中 TRAP-阳性细胞数显著减少 （P＜0.05），200 μg/ml柚皮苷组中TRAP-阳性细胞数非常显著减少（P＜0.01）。柚皮苷剂量与TRAP染色阳性细胞数呈显著负相关（r=-0.749，P=0.001）。

图1 各组TRAP染色所见及阳性细胞计数结果 1a:空白对照组 1b:2 μg/ml柚皮苷组 1c:20 μg/ml柚皮苷组 1d:200 μg/ml柚皮苷组 1e:直方图显示TRAP阳性细胞计数结果，与空白对照组相比 *P＜0.05，**P＜0.001

2.2 骨吸收陷窝

骨吸收陷窝检测见图2，与空白对照组比较，2 μg/ml和20 μg/ml柚皮苷组中薄骨片上骨吸收面积显著减少（P＜0.05），200 μg/ml柚皮苷组骨吸收面积显著减少（P＜0.001）。柚皮苷剂量与骨吸收面积呈显著负相关（r=-0.623，P=0.009）。

图2 各组骨吸收隐窝检测 2a:空白对照组 2b:2 μg/ml柚皮苷组 2c:20 μg/ml柚皮苷组 2d:200 μg/ml柚皮苷组 2e:直方图显示骨吸收隐窝面积检测结果，与空白对照组相比 *P＜0.05，**P＜0.001

2.3 细胞凋亡

流式细胞仪细胞凋亡检测结果见图3。结果四个象限中Q1（左上）象限为PI单阳性，代表细胞膜破坏而核膜存在的细胞，一般指机械损伤细胞；Q2（右上）象限为PI，V-FITC双阳性，代表中晚期凋亡细胞和坏死细胞；Q3（右下）象限为V-FITC单阳性，代表早期凋亡细胞；Q4（左下）象限为双阴性，代表活细胞。与对照组比较，不同浓度柚皮苷中破骨细胞凋亡率均显著升高（P＜0.05）。

图3 各组破骨细胞凋亡 3a:p空白对照组 3b:2 μg/ml柚皮苷组 2c:20 μg/ml柚皮苷组 3d:200 μg/ml柚皮苷组 3e:直方图显示细胞凋亡检测结果，与空白对照组相比，*P＜0.05

2.4 破骨细胞凋亡过程相关基因表达

基因检测结果见表1，与空白对照组比较，2 μg/ml和20 μg/ml柚皮苷组破骨细胞表达BCL-2 mRNA显著下降（P＜0.05），200 μg/ml柚皮苷组破骨细胞表达BCL-2 mRNA显著下降（P＜0.001）。与空白对照组比较，柚皮苷各组BAX表达显著均升高（P＜0.05）。与空白对照组比较，2 μg/ml和 20 μg/ml柚皮苷组中破骨细胞表达caspase-3 mRNA显著升高（P＜0.05）；200 μg/ml柚皮苷组破骨细胞表达caspase-3 mRNA显著升高（P＜0.001）。与空白对照组比较，20 μg/ml柚皮苷使破骨细胞表达mmp-9 mRNA显著降低（P＜0.05），200 μg/ml柚皮苷组使破骨细胞表达mmp-9 mRNA显著降低（P＜0.001）。

表1 不同柚皮苷破骨细胞凋亡相关基因mRNA表达检测结果（±s）与比较

表1 不同柚皮苷破骨细胞凋亡相关基因mRNA表达检测结果（±s）与比较

C a s p a s e-3 M M P-9 1.0 1±0.0 1 1.0 0±0.1 4 1.7 1±0.0 9 0.9 1±0.2 0 1.7 4±0.0 6 0.6 5±0.1 1 2.2 3±0.1 2 0.4 7±0.0 9 0.0 0 6 0.0 3 6

3 讨 论

柚皮苷是一种单体物质，已有的研究表明柚皮苷具有广泛的生物学活性和药理作用，广泛存在于西柚皮、橘皮、骨碎补等水果中，该化合物具有抗炎、抗诱变、镇痛和抗氧化等多种作用［8］。最近有研究表明单体成分柚皮苷有明显的骨保护作用，可增加大鼠骨强度［9］。有报道柚皮苷可联合BMP-2发挥促进小鼠成骨细胞MC3T3-E1增殖分化的作用［10］。Lai等报道壳聚糖包覆的柚皮苷可以增强成骨细胞的扩散、增殖，增强成骨细胞骨形成能力［11］。另外有研究报道柚皮苷可以通过上调miR-20a表达水平和下调PPARγ表达水平来促进的骨生成［12］。此外，研究表明柚皮苷可以通过GALNT2-ANGPTL3信号传导通路，从而改善小鼠高脂血症［13］。作者之前研究也证实，柚皮苷可以促进成骨细胞骨形成作用，改善骨质疏松症大鼠骨量，但柚皮苷抗骨质疏松的机制，特别是柚皮苷对破骨细胞凋亡的影响尚不清楚。

破骨细胞是一种终末的多核巨细胞，在骨重建过程中有重要意义。在骨组织代谢过程中，破骨细胞发挥骨吸收能力，是调节骨重建、骨修复的始动因素［14］。老年骨质疏松患者人群破骨细胞活性增强，强于成骨细胞，导致骨丢失大于骨形成，从而出现骨量降低，骨结构破坏［15］。因此，抑制破骨细胞骨吸收活性是治疗骨质疏松的关键因素。

本研究在体外培养破骨细胞，采用柚皮苷进行干预。研究证实柚皮苷可以明显减少成熟破骨细胞数量，抑制作用与柚皮苷浓度呈正相关。抑制破骨细胞数量同时，柚皮苷能降低骨薄片上骨吸收面积，说明柚皮苷能降低破骨细胞骨吸收活性。流式细胞术检测显示柚皮苷可加速破骨细胞凋亡。

BCL-2及BAX是细胞凋亡过程的关键调节因子，其中BCL-2属于抑制凋亡基因，能减少破骨细胞的凋亡；BAX的作用可使BCL-2丧失抑制细胞凋亡，从而能促进细胞的凋亡［16］。BCL-2和BAX的高低可以决定细胞内线粒体膜电位水平；当细胞表达BCL-2水平下降，BAX表达增高时，可导致线粒体膜电位发生改变，从而进一步促进线粒体释放细胞色素C进入细胞质中，细胞色素C与Apaf-1结合，激活下游因子Caspase-9，三者共同组成激活因子，逐级激活下游的Caspase-6、Caspase-7、Caspase-3，产生级联放大反应［17，18］。Caspase-3 位于细胞凋亡信号Caspase级联反应下游，是最重要的效应型Caspase。Caspase-3是细胞内各种凋亡信号通路传递的终点，是凋亡信号通路的最终执行者，当激活Caspase-3后细胞开始进入不可逆凋亡状态［19，20］。本实验结果证实，柚皮苷促进破骨细胞凋亡的原理可能是通过抑制破骨细胞表达基因Bcl-2，促进破骨细胞表达基因BAX，从而使BCL-2/BAX比值降低，增加破骨细胞内线粒体膜的通透性，线粒体释放细胞色素C入胞质，逐级激活凋亡信号通路，最终使Caspase-3活化，使破骨细胞进入不可逆转的凋亡，从而降低了TRAP阳性细胞数量以及骨吸收能力，MMP-9是破骨细胞骨吸收过程中的重要酶类，可使骨Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原蛋白发生降解［21］。柚皮苷可降低破骨细胞MMP-9的表达，从而抑制破骨细胞对骨的吸收作用，并且其促进破骨细胞凋亡的效果可随着剂量增加而作用增强。

综上所述，本研究证实柚皮苷可以通过改变破骨细胞的凋亡基因表达情况，来促进破骨细胞凋亡的发生，并且效果与浓度成正相关。