离子色谱法同时测定那屈肝素钙中氯离子和硫酸根离子的含量

范卫平

(北京虹木生物技术有限公司，北京 101105)

前言

那屈肝素钙系从猪小肠黏膜中提取的肝素经亚硝酸裂解后，精制而得的硫酸氨基葡聚糖的钙盐，是低分子量肝素的一种[1]。那屈肝素钙临床用于预防术后血栓栓塞、肺栓塞、深静脉血栓形成、末梢血管病变等，是目前抗凝血、抗血栓形成的主要治疗药物之一[2]。那屈肝素钙在生产和长期储存过程中，其糖链上的磺酸基团易解离为游离硫酸根，且在获取肝素原料及生产过程中(如加入氯化钙进行钠钙置换)还会引入其他阴离子如氯离子等，为了确保那屈肝素钙药物的纯度和稳定性，对这些离子的监测是非常必要的[3]。

离子色谱法始于1975年，系用具离子交换功能的有机聚合物载体或无机载体为填充剂，以稀碱溶液、碳酸盐缓冲液为洗脱液，以电导检测器、安培检测器等来分析样品中的阴离子或阳离子的色谱方法，具有操作简单、选择性好、灵敏度高、分析时间短、可同时测定多组分等特点[4]。离子色谱仪自问世以来发展迅速，在医药、食品、生物、环境、农业、电子等领域均得到广泛应用，是高效液相色谱法的重要分支[5]。虽然离子色谱法在分析化学中发展很快，但相对于高效液相色谱法、紫外-可见分光光度法等常用仪器分析方法，《中华人民共和国药典》自2010年才将其首次收载，2015年修订后收录至四部通则。在其他各国药典中，《英国药典》最先将离子色谱法作为各类品种测定方法收载，随后《美国药典》、《欧洲药典》等也先后收载[6]。

在中国药典委员会2017年6月发布的《关于那屈肝素钙国家标准的公示》里，游离硫酸盐的含量测定采用离子色谱法，但《中国药典》2015版里对于氯化物的检查采用比色法[7]，存在操作步骤繁琐、灵敏度较低以及抗干扰能力较差等缺点。离子色谱法作为一种新兴的分析技术[8]，在各个行业都已得到广泛应用的同时，具备同时进行多种离子分析的特点[9-14]，而且灵敏度高、分析速度快。本文采用标准曲线法，建立了一种离子色谱法同时测定那屈肝素钙中氯离子和硫酸根离子含量的方法，该法简便、可靠，灵敏度高。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

ICS-6000离子色谱仪(赛默飞世尔科技有限公司，配有淋洗液发生器)，色谱柱(赛默飞世尔科技有限公司，强阴离子交换柱AS22)；硫酸根溶液标准物质(GBW(E)080266，标准值：1 000 μg/mL)，氯单元素溶液标准物质(GBW(E)082515，标准值：1 000 μg/mL)，那屈肝素钙(批号191119)。

1.2 色谱条件

色谱柱：强阴离子交换柱(赛默飞世尔科技有限公司，AS22，4.0 mm×250 mm)；流动相：3 mmol/L碳酸钠溶液；流速：2.0 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：25 μL；检测器：配有化学抑制器的电导检测器。

1.3 溶液配制

1.3.1 对照品溶液的制备

准确移取氯标准溶液1.00 mL和硫酸根标准溶液1.00 mL，置于同一50 mL容量瓶中，用水稀释成含氯离子和硫酸根离子20.00 μg/mL的混合溶液，并依次稀释制成含氯离子和硫酸根离子为10.00、5.00、2.00、1.00 μg/mL的系列浓度对照品溶液，每次测试以流动相为空白溶液。

1.3.2 供试品溶液的制备

取那屈肝素钙约25 mg(精确至0.1 mg)，置于10 mL量瓶中，用水溶解并稀释制成2.5 mg/mL的溶液，过滤，取续滤液作为供试品溶液。平行制备两份。

1.4 系统适用性实验

精密量取“对照品溶液的制备”项下含氯离子和硫酸根离子浓度为5 μg/mL的对照品溶液25 μL，注入离子色谱仪，记录色谱图，结果表明，氯离子峰与硫酸根离子峰能彻底分开，其中氯离子峰塔板数为7234，硫酸根离子峰塔板数为8405，分离度为14.18。

1.5 供试品含量测定

精密量取“对照品溶液的制备”项下系列浓度对照品溶液各25 μL，注入离子色谱仪，记录色谱图，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线并计算线性回归方程。取那屈肝素钙2份，精密称定，照“供试品溶液的制备”项下方法制备，各精密量取25 μL注入离子色谱仪，记录色谱图，用线性回归方程计算供试品中氯离子和硫酸根离子的含量。结果表明，191119批含氯离子0.069%，含硫酸根离子0.028%。实验结果见表1。

表1 供试品中氯离子和硫酸根离子的含量Table 1 The content of chloridion and sulfate ion in the tested sample

2 结果讨论

2.1 色谱柱的选择

本实验分别考察了AS11、AS14、AS19、AS22等四种强阴离子交换色谱柱，其中AS11与AS19色谱柱为氢氧化物淋洗液选择性阴离子交换色谱柱，实验发现，当使用3 mmol/L碳酸钠溶液为流动相时，浓度为20 μg/mL的对照品溶液色谱图中氯离子峰不对称度较大，峰形略有拖尾。AS14色谱柱具有出色的卤化物保留能力，但实验发现，硫酸根离子峰保留时间约为12.8 min，当样品运行时间为15 min时，不能保证主峰后有足够的时间来冲洗及平衡色谱柱，若加长运行时间则影响实验效率。因此选择AS22色谱柱，其氯离子和硫酸根离子分离度良好，主峰峰形不拖尾，且硫酸根保留时间为9.5 min左右，15 min便可完成样品分析。

2.2 流速的选择

分别考察了1.0、1.5、2.0 mL/min等不同流速对实验结果的影响。结果表明，当流速为1.0 mL/min和1.5 mL/min时，浓度为20 μg/mL的对照品溶液色谱图中氯离子峰不对称度分别为1.61和1.92；而流速为2.0 mL/min，不对称度为1.19，峰形较好，不影响结果计算。因此，选择流速为2.0 mL/min。

2.3 流动相及浓度的选择

离子色谱法测定氯离子、硫酸根离子等无机强酸阴离子常用碳酸钠溶液为流动相，分别考察了1、3、5 mmol/L等不同浓度碳酸钠溶液流动相对实验结果的影响。结果表明，当碳酸钠溶液浓度为1 mmol/L时，氯离子检出限为0.1 μg/mL，而3 mmol/L时，氯离子检出限为0.01 μg/mL；当碳酸钠溶液浓度为5 mmol/L时，浓度为20 μg/mL的对照品溶液色谱图中氯离子峰不对称度为1.49，大于3 mmol/L时的1.19。因此，选择3 mmol/L碳酸钠溶液为流动相。

2.4 柱温的选择

实验分别考察了25、30、35 ℃等不同柱温对实验结果的影响。结果表明，不同温度对实验结果影响较小，但若柱温不稳定则会造成基线波动影响峰面积。考虑到柱温箱控温能力，将柱温定为30 ℃。

2.5 方法学验证

2.5.1 系统适用性

精密量取“对照品溶液的制备”项下含氯离子和硫酸根离子浓度为5 μg/mL的对照品溶液25 μL，注入离子色谱仪，记录色谱图，连续进样6次。结果表明，氯离子峰面积分别为0.654、0.655、0.645、0.643、0.640、0.652 μS·min，相对标准偏差为0.99%；硫酸根离子峰面积分别为0.599、0.579、0.586、0.582、0.591、0.599 μS·min，相对标准偏差为1.20%。RSD均小于2.0%，该方法系统适用性良好。实验结果见表2。

表2 系统适用性实验结果Table 2 The result of system suitability test

2.5.2 专属性

精密量取空白溶剂25 μL，注入离子色谱仪，记录色谱图；精密量取“对照品溶液的制备”项下含氯离子和硫酸根离子浓度为5.00 μg/mL的对照品溶液25 μL，注入离子色谱仪，记录色谱图。结果表明，空白溶剂色谱图中，除基线噪音外，未见明显色谱峰；5 μg/mL 的对照品溶液色谱图中，氯离子峰保留时间为3.692 min，硫酸根离子峰保留时间为9.522 min。氯离子峰与硫酸根离子峰能彻底分离，且空白溶剂对氯离子峰和硫酸根离子峰均不干扰，该方法专属性良好。实验结果见表3。

表3 专属性实验结果Table 3 The result of specificity test

2.5.3 准确度实验

精密量取氯标准溶液和硫酸根标准溶液各1.00 mL，置于同一20 mL量瓶中，用水稀释至刻度，制成含氯离子和硫酸根离子浓度分别为50.00 μg/mL的溶液，作为准确度实验储备溶液。取那屈肝素钙样品约25 mg，精密称定，置于10 mL量瓶中，平行9份，其中3份加入储备溶液0.8 mL，3份加入储备溶液1 mL，3份加入储备溶液1.2 mL，用水稀释至刻度，过滤，取续滤液作为准确度实验供试品溶液。精密量取各准确度实验供试品溶液25 μL，注入离子色谱仪，记录色谱图。结果表明，9份供试品氯离子平均回收率为101%，RSD为2.0%；硫酸根离子平均回收率为101%，RSD为2.1%；该方法准确度良好。实验结果见表4和表5。

表4 氯离子准确度实验Table 4 The result of accuracy test of Cl-

表5 硫酸根离子准确度实验Table 5 The result of accuracy test of SO42-

2.5.4 精密度实验

照“供试品溶液的制备”项下方法，取那屈肝素钙约25 mg，精密称定，置于10 mL量瓶中，用水溶解并稀释制成2.5 mg/mL的溶液，过滤，取续滤液作为精密度实验供试品溶液，平行操作6份。精密量取各精密度实验供试品溶液25 μL，注入离子色谱仪，记录色谱图。结果表明，6份供试品氯离子含量RSD为2.8%，硫酸根离子含量RSD为5.8%。该方法精密度良好。实验结果见表6。

表6 精密度实验结果Table 6 The result of precision test

2.5.5 检出限与定量限

精密量取“对照品溶液的制备”项下含氯离子和硫酸根离子浓度为1.00 μg/mL的对照品溶液适量，依次稀释成含氯离子和硫酸根离子浓度分别为0.1、0.01 μg/mL的溶液，作为检出限实验供试品溶液。精密量取各检出限实验供试品溶液25 μL，注入离子色谱仪，记录色谱图。结果表明，当浓度为0.01 μg/mL时，氯离子信噪比为3.8，硫酸根离子信噪比为10.6。因此，该方法氯离子和硫酸根离子的检出限为0.01 μg/mL。实验结果见表7。

表7 检出限实验结果Table 7 The result of LOQ test

因该方法结果计算为标准曲线法，故该方法氯离子和硫酸根离子的定量限为标准曲线溶液的最小浓度，即1.00 μg/mL。

2.5.6 线性范围

精密量取“对照品溶液的制备”项下各浓度对照品溶液25 μL，注入离子色谱仪，记录色谱图。结果表明，在1～20 μg/mL的范围下，氯离子线性方程为y=0.131 4x-0.008 1，线性相关系数R2=0.999 9；硫酸根线性方程为y=0.123x-0.009 8，线性相关系数R2=0.999 8。该方法线性关系良好。实验结果见图1。

图1 氯离子(a)与硫酸根离子(b)的线性回归方程Figure 1 Linear regression equation of Cl-(a)and SO42-(b).

2.5.7 溶液稳定性

按照“供试品溶液的制备”项下方法，取那屈肝素钙约25 mg，精密称定，置于10 mL量瓶中，用水溶解并稀释制成2.5 mg/mL的溶液，过滤，取续滤液作为溶液稳定性实验供试品溶液。分别于0、1、2、4、8、12、24 h时精密量取溶液稳定性实验供试品溶液25 μL，注入离子色谱仪，记录色谱图。结果表明，氯离子峰面积分别为0.199、0.192、0.195、0.198、0.201、0.195、0.196 μS·min，RSD为1.5%；硫酸根离子峰面积分别为0.080、0.075、0.077、0.082、0.082、0.077、0.079 μS·min，RSD为3.4%。供试品溶液稳定性良好。实验结果见表8。

表8 溶液稳定性实验Table 8 The result of solution stability test

2.5.8 耐用性

同时也考察了流速、流动相浓度、柱温等色谱条件有小的变动后，对5 μg/mL的对照品溶液的色谱峰结果的影响。结果表明，当流速为1.8 mL/min时，氯离子峰和硫酸根离子峰略有拖尾，峰面积RSD较大；而流动相浓度和柱温小的变动能满足系统适用性要求。实验结果见表9。

表9 耐用性实验结果Table 9 The result of durabiLity test

3 结论

本文初次将离子色谱法应用于同时测定那屈肝素钙中的氯离子和硫酸根离子的含量，一份溶液同时测定，很好地解决了传统方法费时、不能同时测定两种离子的问题。方法操作简便，稳定性好，结果准确可靠，实验过程绿色无污染，该方法可作为那屈肝素钙中氯离子和硫酸根离子测定的质量控制方法。