发酵工程技术在食品添加剂领域的创新应用

陈震，苗馨，孔明慧，何梦凡，张俊丽，代亚峰

(信阳师范学院 生命科学学院，河南 信阳 464000)

随着科技的进步和社会的发展，人们对食品开发领域的关注越来越多。以前，人们往往只注重于食物的数量，时过境迁，现在的人们更加重视食品的感官、味道、营养与安全。因此，目前有很多的食品都使用了大量的添加剂，而这些添加剂的来源及安全性成为了人们关注的重点。现在的消费者们也更加注重健康的饮食习惯，追求天然的食品成分，但是仅仅依靠天然萃取获得的食品添加剂远远不够人们所食用。当下，有一种技术可以生成与天然萃取一样健康的成分，这就是发酵工程技术。尽管许多人知道发酵可以生产醋、豆瓣酱、啤酒、奶酪及味精等传统产品，但很少有人知道它还可以创造出其他新的食品成分。现代发酵工程技术与传统发酵不完全相同，现代发酵工程技术生产者不向发酵材料中直接接种起始生物，而是将目标基因直接插入宿主生物中，然后利用发酵培养基培养目标生物并生产副产品成分，生产者可以从发酵物中提取目的成分并纯化以供使用。发酵工程技术运用于食品开发领域，可以充分发挥出发酵工程的魅力，不仅丰富了发酵产品的种类，而且提升了食物的口感与品质，减少了食品添加剂的制作难度，更能够消除人们对食品添加剂的恐慌。随着科技的持续发展，发酵技术在食品添加剂领域一定会大有作为。本文介绍了几种常见的食品添加剂，并逐一介绍了发酵工程技术在其中的创新性应用，为今后利用发酵工程技术生产新型食品添加剂的研究提供了参考。

1 着色剂

能够使物质显现出设计所需要的颜色的物质被统称为着色剂。在食品行业，着色剂又经常被叫作食用色素，常被用来给食物染色，改善食品的色泽，使得食物的外表颜色更加符合人们的需求。通常情况下食用色素分为两大类：天然色素和人工合成色素[1]。

大豆血红蛋白是一种存在于豆科植物根瘤中类似哺乳动物血红蛋白的一种红色色素，它原本是根瘤中类菌体呼吸作用和固氮作用的协调剂。血红蛋白是血液中携带氧气的分子，用于氧气运输呼吸和其他代谢功能，在我们所食用的食物如家禽、肉、鱼制品由大都有血红蛋白的存在，肉类中的血红蛋白赋予了肉类独特的口感，因此血红蛋白可用于肉制品的加工[2]。为了满足全球对肉类的需求以及减少对环境的影响，Impossible Foods将大豆血红蛋白这种植物来源的“血红素”用于人造肉的染色，使人造肉的外观、口感接近真正的肉类。2019年，美国食品药品管理局已批准大豆血红蛋白作为碎牛肉类似产品的色素添加剂。

固氮植物(例如大豆或豆科植物)会自然产生血红素并将其存储于根部，从这里可以提取一定的大豆血红蛋白，但是其成本会变得非常高，而且也会造成环境的破坏。目前，已经实现了大豆血红蛋白的发酵生产，通过发酵生产的大豆血红蛋白可以使人造肉变红，并让其口感更加接近真实的肉。Jin Y等[3]通过基因工程和发酵酵母生产天然存在于植物中的血红素蛋白，他们将大豆植物中编码合成大豆血红蛋白的LegHb基因插入酵母宿主菌Pichiapastoris(现在重新分类为Komagataellaphaffii)进行表达，然后通过酵母细胞发酵产生大豆血红素。实验结果表明，纯化得到的毕赤酵母菌株中表达的LegHb 蛋白质纯度大于65%，以这种方式生产的大豆血红蛋白已经在基于植物的肉制品中进行了测试，浓度高达0.8%。安全测试结果表明，添加毕赤酵母发酵生产的重组大豆血红素的食品不太可能对消费者产生不可接受的过敏性或毒性风险。通过微生物发酵法获得的大豆血红蛋白，未来将在人造肉及其他食品领域中发挥更大的作用。

2 甜味剂

能够赋予食品甜味的食品添加剂通常被称为甜味剂。 甜味剂通常具备以下几特点：引起的味觉良好、安全性高、稳定性好、水溶性好、价格合理。甜味剂在很多食品中均有一定的应用，比如：增强食物的甜度、使食物形成一定的风味，对风味的调节和增强。适量地使用甜味剂可以使产品获得良好的口感，又能使食物保持新鲜的味道。

甜菊糖，俗称甜菊糖苷(stevioside)，是一种植物无热量代糖品，它是从菊科植物甜叶菊的叶子中提取出来的一种糖苷，甜叶菊的叶含有甜菊醇糖苷的混合物，并在南美用作天然甜味剂已有数百年历史。甜菊糖苷的安全性已通过对其分解代谢及其作为食品添加剂的用途的研究得以确定，从而使其在美国和欧盟得到普遍使用。甜菊糖苷由二萜类甜菊醇骨架组成，在骨架上饰有1～3个葡萄糖。甜菊糖的甜度是蔗糖的200～350倍，但热量却只有蔗糖的1/300，甜菊糖的甜度高、热量低，是一种基本不会在人体内残留的天然食品添加剂[4]。因其热量较低，甜菊糖可以用来制作一些低热量的食品供给一些特殊人群(如糖尿病、肥胖人群、三高患者)食用。此外，甜菊糖苷具有独特的清凉、甘甜特点，可以用来制作糖果，也可用作矫味剂，抑制一些药物或者食品的怪味和苦味。

在所有糖苷中，五糖苷Reb D是最甜的，且苦味低，六糖苷Reb M具有高甜度、快速和干净味道的特性，因此Reb D和Reb M是目前最优质的高潜力的天然甜味剂。但是Reb D和Reb M只存在于甜叶菊叶中，且含量非常低(约占干重的 0.4%～0.5%)，这使得从甜叶菊植物中纯化这两种化合物用于工业用途不切实际且成本高。编码SGs包括Reb D和Reb M生物合成的基因已被筛选鉴定，SGs的合成途径已成功在酿酒酵母中表达，酵母微生物提供了Reb D和Reb M的异源生产替代场所[5]。因此，可以通过酵母发酵来生产存在于甜叶菊叶片中的Reb M和Reb D分子，有望借助微生物发酵技术实现商业化大规模生产下一代甜叶菊甜味剂，据调查，预计到2025年，发酵法生产的高强度甜菊糖甜味剂市场将超过30亿美元。

3 营养强化剂

营养强化剂是指为了增强营养价值而向食品中加入的天然或者人工合成的属于天然营养素范围的食品添加剂，这种经过添加的食品也被称为强化食品。食品营养强化剂是一类重要的食品添加剂，用于补充人体部分营养素，在食品中添加营养强化剂可以增强食物的营养成分，增加人们因某些原因所缺少的部分营养，增强身体素质，并将影响人们身体健康的风险降到最低。营养强化剂的作用不仅仅是减少疾病、调节健康，借助营养强化剂预防疾病甚至治疗某些疾病已经成为营养强化剂发展的新方向。

维生素K2是应用最早的一种营养强化剂，它能够有效地预防血管钙化和骨质疏松以及一些癌症的发生，同时能够补充身体内的蛋白质，它不但能够促进凝血酶原的形成，加速凝血，保证凝血的正常，还能够有效地帮助骨头和血液保持正常。维生素K2在食品中的含量极少，但也是人体所必需的一部分 ，维生素K2有着“铀金维生素”之称，同时维生素K2也被广泛用于医药工业中。

维生素K并非是一种单一的物质，而是一类具有醌类结构的脂溶性化合物。维生素K主要分为两种：第一种是维生素K1，也被称为叶绿醌，其主要来源于植物中；第二种即维生素K2，主要是微生物代谢产生的，最初来源于纳豆。维生素K2，常态为淡黄色粉末状。通常肠道内的细菌可以合成维生素K2，一般不会引起缺乏，但当大量使用抗菌素，肠道细菌不能合成维生素K时，会引起缺乏症。维生素K2是一类具有相同2-甲基-1,4-萘醌环不同长度侧链的系列衍生物，由于异戊二烯侧链在C-3上的长度不同，维生素K2可以分为14种，分别以MK-n表示(其中n表示侧链异戊二烯单位数)。其中，MK-7是维生素K2中最具生物活性形式的。

以前，人们主要从奶酪和日本纳豆等食物中获得维生素K2，但维生素K2在食品中含量非常少，因此通过细菌发酵是天然产生该活性成分的最好方法。然而MK产量较高的菌种不多，目前主要利用枯草杆菌(Bacillussubtilis)[6]来发酵生产MK-7。Natto Pharma公司利用具有高生产能力的芽孢杆菌，并以蔬菜基质来发酵生产MK-7，经提取纯化和浓缩后，可获得不含已知过敏原的优质活性成分。目前，对微生物法生产维生素K2的研究主要体现在菌种的诱变和发酵条件的优化上。Yoshinori 等[7]利用紫外和亚硝基胍结合的诱变方法，筛选得到一株BacillussubtilisOUV23481高产菌株，其产量高达1719 μg/100 g，是出发菌株产量的2倍。最近，Novin等[8]利用牛奶作为培养基发酵Bacillussubtilisnatto生产维生素K2，经过条件优化后，制备得到一种富含MK-7(3.54 mg/L)的乳制品。国内方面，杜亚飞等[9]对纳豆芽孢杆菌进行DES诱变和紫外诱变，筛选得到维生素K2高产的营养缺陷型菌株，并通过响应面优化，产量最终达到51.23 mg/L。

4 功能性食品添加剂

目前的研究结果表明，大多数食品除了自身具有营养功能和感觉功能外，还具有调节高级生命活动的功能，具备该特性的食品又被称为功能食品，而其中的有效成分则能称为功能性食品成分。这些功能成分具有生理活性，它们可对体内固有的生理调节因子发生刺激作用，或与体内的特定组织器官发生作用，使其功能增强或受到抑制，从而对生命活动进行调节。

虾青素(虾红素)，是一种橙红色脂溶性的类胡萝卜素，易溶于有机溶剂中，具有较强的天然抗氧化性，被称为“超强维生素”，是迄今为止人类发现的自然界中最强的一种抗氧化剂。在自然界中，虾青素大都存在于微生物(如酵母、微藻、细菌)、甲壳类动物(如虾、蟹等)、鱼类和一些鸟类的体内[10]。虾青素具有提高免疫力、抗癌、抗氧化等生物学功能，因此具有广阔的开发潜力，在化妆品、保健品、医药、水产养殖和饲料添加剂等方面均具有很大的利用价值和发展潜力，常被作为功能性食品添加剂用于食品、保健品或药品中，对改善人类健康具有切实意义。同时，虾青素还具有提高水产动物产卵率、促进生长和抗病防病的效果。在过去，人们主要从甲壳类动物中提取虾青素，但是其经济和环境成本较高。虾青素也可通过化学合成的方法获得，但化学合成虾青素费用昂贵，且多为顺式结构，与天然虾青素不同。现在，人们更倾向于利用酵母发酵的方法来生产虾青素，这种方法具有易操作、环境友好、成本低等优势，且虾青素提取后的菌体单细胞蛋白可作为饲料添加剂，是一种极具产业化前景的天然虾青素生产方法。Nextferm Technologies公司利用酵母发酵生产的虾青素与藻类来源的虾青素相比，该虾青素具有略微不同的微型结构，能够被迅速有效地吸收，从而提高其生物利用度，其功效是其他虾青素的4倍。目前，对于虾青素的发酵研究主要集中于虾青素高产菌株的筛选和改造上，其中红发夫酵母生产虾青素产量较高，是实现虾青素工业化生产的途径之一[11]。

EPA与DHA是两种人体必需的多不饱和脂肪酸，一般存在于海藻和深海鱼类的脂肪中。EPA和DHA对人体的健康有着重要的意义，EPA可以预防心血管疾病、免疫性疾病、牛皮癣、风湿病和肠道疾病等[12]，而DHA能够治疗抑郁症、保护视力和促进婴幼儿脑部发育[13]。目前，EPA和DHA的主要来源仍然是鱼油，但是鱼油的质量受到鱼的种类、捕捉季节和捕捉地域的限制，鱼油成分复杂、异味重，纯化成本非常高，这大大阻碍了EPA和DHA的大规模生产和商业应用的发展。研究发现，微生物包括藻类、海洋细菌和真菌，都能合成EPA和DHA等不饱和脂肪酸。微生物发酵法生产的EPA和DHA具有稳定性较好，可以人为控制，更易于分离纯化和工业化等优点，这也是近年来研究的热点。其中，裂殖壶菌可通过异养繁殖生长，其生长繁殖快，耐受机械搅拌，适宜发酵罐大规模培养。美国Martek公司已成功利用裂殖壶菌生产DHA，生物量干重可达到170～210 g/L，其中脂质占50%[14]。目前，该菌已被用于DHA的工业化生产，其细胞油脂含量高，其发酵产品的生产不受季节影响，无毒物污染，成分稳定，并已被美国及欧洲有关食品权利机构批准添加至相关食物中使用。国内外常见的裂殖壶菌生产的多不饱和脂肪酸主要以DHA为主，产量在0.33～41.3 g/L之间，而生产EPA较少，这一方面的研究工作还有待加强。

5 多糖类食品添加剂

生物多糖是由通过糖苷键连接的长链单糖单元组成的高分子碳水聚合物，天然产物中多糖的结构复杂，支链结构多样，但其主链的基本结构通常是葡聚糖、木聚糖、果聚糖、半乳聚糖及甘露聚糖等，或者是两种或多种单糖的聚合物，根据聚合度和分子量不同，可分为低聚糖和高聚糖。越来越多的研究[15-16]表明许多生物多糖具有抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、降血脂和提高免疫力等功效，可以当作营养强化剂来增强食品的功能，在食品工业中还可以作为增稠剂和保鲜剂使用，此外生物多糖还能防止淀粉老化，改良淀粉品质。因此，生物多糖的提取及生产技术的研究日益受到广泛关注。生物多糖在自然界中广泛存在，可从高等植物、真菌、藻类和细菌等中获得。从植物中直接提取分离的多糖纯度和效率较低。目前，微生物发酵技术已成功用于发酵生产细菌和真菌多糖，也有利用微生物发酵技术促进生物多糖的释放及生物活性。

灵芝是一种名贵的食药用真菌，在食品中的应用非常广泛，不仅可以作为药品和功能性保健食品使用，还可作为添加剂被制作成各种功能性复合调味品，如灵芝酱油和灵芝醋等[17]。作为灵芝最重要的药理活性成分之一，灵芝多糖具有重要的生物学功能，除了具有抗氧化、抗肿瘤、抗辐射等生物活性外，还具有免疫调节、降血糖等药理作用，传统栽培的灵芝容易受到环境、栽培方式等因素的影响，且生长条件难以控制，导致质量差异较大，子实体中活性成分质量不稳定，而且生产周期较长，灵芝栽培成本较高。随着生物技术的不断发展，目前具有操作简单、周期短、可大规模生产等优点的液体发酵技术已被广泛应用于灵芝多糖的生产。Feng J等[18]利用液体深层发酵技术对灵芝菌丝体进行发酵生产灵芝多糖，并通过中心复合试验设计法对其发酵培养基进行优化，在5 L和50 L发酵罐中，灵芝多糖的产量分别高达2.59，2.65 g/L，有效地提高了灵芝多糖的产量，且获得的灵芝多糖具有良好的免疫活性，优化后的发酵工艺可以用于灵芝多糖的大规模生产。

铁皮石斛是另外一种重要的药材，具有极高的药用和食用价值，也被广泛用于调味品如酱油、调味汁和料酒中，以增强调味品的营养，而铁皮石斛多糖的含量和活性决定了铁皮石斛的品质。微生物具有丰富的酶系，能够分解转换物质并且合成次级代谢产物。铁皮石斛的成分和结构复杂，使得其活性物质尤其是多糖被包裹，药性不能得到完全释放。通过微生物发酵技术可以破坏铁皮石斛的细胞壁，促进中药活性物质的释放， 提高多糖的提取率，此外微生物还可以通过代谢提高多糖的生物活性。王丹等[19]利用不同的微生物对铁皮石斛水提液进行纯种发酵，发现微生物发酵可以降低铁皮石斛多糖的分子量，并且可以提高铁皮石斛的抗氧化活性和体外降血糖活性，为纯天然绿色铁皮石斛的多糖研制成降糖保健品奠定了基础。

水苏糖是一种天然存在的功能性低聚糖，能够增殖肠道益生菌，抑制腐败菌生长，具有促进肠道蠕动的作用，同时水苏糖还能保护肝功能，增强机体免疫力，可以作为一种新型食品添加剂使用。从天然原料中直接提取的水苏糖产品纯度较低，限制了它的应用。舒丹阳等[20]以草石蚕糖液为原料，利用混菌发酵技术生产高纯度水苏糖，精制纯化后的水苏糖含量高达78.13%，为高纯度水苏糖的大规模生产和应用提供了理论和实践指导。

6 结论与展望

发酵是一个非常复杂的生物过程，需要无懈可击的卫生措施和严格精密的条件控制，以确保所需的微生物能够不受有害微生物的影响，并且满足人类的生产要求，随着科技水平的快速提升，发酵工程技术也得到了不断的发展。总体来说，相比直接提取和化学合成法，发酵能产生更高质量和高纯度的成分，而且发酵过程是安全可控、可追溯的，相信发酵生产的食品原料能够得到大多数消费者的认可。

随着社会的进步，人们也愈发注重食品的质量与安全问题，食品添加剂在人们的生活中也更为常见，利用发酵技术生产食品添加剂已经十分广泛。另外，随着基因工程的发展，人们可以有针对性地将目的产物的基因导入到枯草芽孢杆菌或者酵母这些安全的宿主菌中进行表达，再结合发酵工程技术来生产相应的食品添加剂，不仅能够提升食品的开发效率，同时也能够保障食品的品质。相信在未来运用发酵工程技术能够安全有效地生产出越来越多的新型食品添加剂，而食品也会变得越来越健康、美味。