脾虚湿阻型单纯性肥胖小鼠模型的构建及评价*

朱梦梦，王立鑫，封若雨，张泽家，赵天赐，葛少钦△

(1. 河北大学，河北 保定 071002； 2. 徐州矿务集团总医院，江苏 徐州 221006)

肥胖症在临床根据病因可分为单纯性和继发性肥胖，其中占95%的单纯性肥胖因没有明显的原发病而成为临床研究的难点[1]。中医将单纯性肥胖分为脾虚湿阻型、胃热湿阻型、肝郁气滞型、脾肾阳虚型、阴虚内热型，其中脾虚湿阻型肥胖在临床上较常见[2-4]。课题组前期研究发现，高脂饮食诱导的雄性肥胖小鼠与正常小鼠比较体质量增加明显，血清中瘦素、胰岛素及血脂水平显著增高，葡萄糖耐量异常，但尚未构成糖尿病等代谢性疾病，系单纯性肥胖。鉴于目前实验性肥胖动物模型缺乏证候的关联性资料，为复制出符合中医证型的肥胖动物模型，进一步探讨中医药治疗肥胖的机制等，本研究在前期工作的基础上，以高脂饮食加水湿垫料因素构建脾虚湿阻型单纯性肥胖小鼠模型，依据中医脾虚湿阻证的表征，观察小鼠是否出现肢体痿软困重、胸脘胀满、纳差食少、怠惰便溏等现象[5]，并结合小鼠每日进食量、饮水量、粪便含水量、疲劳乏力等情况为依据进行筛选及症状评分，再以小鼠的血糖血脂水平、脂肪体积、葡萄糖耐量以及胰岛素抵抗现象等对脾虚湿阻单纯性肥胖小鼠模型进行评价。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

SPF级雄性C57BL / 6 N小鼠3周龄100只，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号SCXK(京)2016-0006。随机分为正常组和模型组2组，正常组20只，模型组80只。本实验已通过河北大学实验动物伦理委员会审查。

1.1.2 试剂与仪器 疲劳转棒仪(成都泰盟科技有限公司)，全自动生化仪(7600-110，日本日立有限公司)，Quantum FX micro-CT(PerkinElmer)，50%葡萄糖注射液(石家庄四药有限公司，中国)，胰岛素注射液(江苏万邦生化医药集团有限责任公司，中国)，血糖试纸、血糖仪(三诺生物传感股份有限公司，中国)。

1.2 方法

1.2.1 造模方法及筛选 小鼠在河北大学SPF级实验动物中心适应性饲养1周后，随机抽取20只作为正常对照组，采用普通饲料喂养，另80只以高脂饲料喂养3周后，自第4周增加水湿垫料因素(50 g垫料加水100 ml)，共造模10周。造模期间观察小鼠的生理状态并记录，每周固定时间称量2组小鼠体质量，体质量增加>20.0%的可初步判定为肥胖。造模10周后测量小鼠体长和腰围，根据公式计算各组小鼠的Lee’s指数：Lee’s指数=体质量1/3(g)/体长(cm)×103。

生理状态记录：根据脾虚湿阻证的表征观察肥胖小鼠是否出现萎靡、倦怠、反应迟纯、眯眼、嗜睡、毛色散乱不洁、小便色黄而少以及大便量少黏腻等现象。

疲劳乏力实验：将小鼠放在疲劳转棒仪上，通过疲劳乏力检测系统，记录2组小鼠3 min内在转棒仪上运动站立的时长，运动站立时长小于正常组1倍标准差者定义为乏力鼠。

每日进食量、饮水量：给小鼠投喂饲料和水的过程中，提前称量饲料克数，量取水的体积并做好记录。每日早晨8∶00量取剩余水的体积，称取鼠笼食盒中剩余食物量。每日进食量、饮水量明显小于正常小鼠者，定义为食少纳呆鼠。

粪便含水量：每周定期采集2组小鼠3 h内的新鲜粪便，称取粪便湿重，于80 ℃、7h条件下烘干粪便称重，计算粪便的含水量：粪便含水量=(粪便湿重-粪便干重) /粪便湿重。粪便含水量高于正常小鼠的定义为便溏鼠。

造模筛选指标及症状评分：①行为：倦怠 (无0分，有1分)，扎堆(无0分，有1分)，嗜卧(无0分，有1分)，动作缓慢(轻度缓慢1分，重度2分)，动作缓慢判断指标包括悬空拉尾抵抗力弱(2分)； ②精神状态：正常0分，萎靡(1分)，常眯眼(1分)，反应迟钝(2分)；③毛发、耳尾及肛门部：毛发耳尾肛门均正常0分，毛发稀疏(1分)，枯黄无光泽 (2分)，耳尾血色淡(1分)；④排便：正常0分，大便稀溏、便软不成形(1分)或泻下如水样(2分)；⑤造模5周后，正常0分，大鼠进食量少(1分)，体质量增长缓慢或下降(2分)；⑥体温下降，数字式医用远红外热成像仪观察动物远红外辐射的温度变化(一般1分，明显2分)；⑦舌体胖大质淡苔白滑(质正常淡红无苔0分，淡红有薄苔1分)。

造模组体质量增加>20.0%，且筛选指标及症状评分≥10分者，定为脾虚湿阻型单纯性肥胖小鼠。

1.2.2 检测指标

(1)葡萄糖耐量实验(glucose tolerance test, GTT)：对小鼠禁食不禁水12 h后，依据每只小鼠体质量(4ul/g)腹腔注射浓度50%的葡萄糖溶液，分别于第 0、30、60、90、120分钟时剪小鼠尾尖的一部分获得静脉血，随即用血糖试纸测量并记录血糖值。

(2)胰岛素抵抗实验(intraperitoneal insulin tolerance test, ITT)：对小鼠禁食不禁水6 h后，依据每只小鼠体质量(0.75 IU/g)腹腔注射胰岛素溶液，分别于第 0、30、60、90、120分钟剪小鼠尾尖的一部分获得静脉血，随即用血糖试纸测量并记录血糖值。

(3)小动物CT成像(micro-CT)：实验采用mirco-CT检测并计算小鼠皮下、腹部和内脏脂肪的分布及总体积。将小鼠进行麻醉但不致死，固定于鼠床上，采用高分辨率模式进行扫描检测2组小鼠的脂肪分布。将扫描所得的投影数据进行重建并导入分析软件，选取参照点调整密度区间，屏幕内只留下脂肪密度的部分并染色，然后根据各个层面进行叠加计算得出总的脂肪体积。

(4)小鼠脏器湿重及脏器系数：用1%的戊巴比妥钠麻醉小鼠，眼球取血之后立即解剖， 迅速摘除肝脏、脂肪等组织，电子天平称重并记录数据。计算脏器系数：脏器系数=(器官质量(g)/小鼠体质量(g)×100%。组织存放于-80 ℃冰箱备用。

(5)血清生化测定：采用全自动生化仪检测小鼠血清中葡萄糖(GLU)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)和极低密度脂蛋白(VLDL)水平。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 2组小鼠生理状态比较

图1示，正常组小鼠毛色顺滑，比较活跃，反应灵敏；而脾虚湿阻型单纯性肥胖小鼠则出现毛色散乱不洁、萎靡、倦怠、反应迟钝和抱团现象。

图1 2组小鼠的生理状态图

2.2 小鼠体质量、体长、腰围及Lee’s指数比较

表1示，模型组小鼠的体质量、体长、腰围和Lee’s指数都高于正常组(P<0.01)。

表1 小鼠体质量、体长、腰围及Lee’s指数比较

2.3 小鼠每日饮食量、饮水量比较

表2示，模型组小鼠的每日饮食量、饮水量都低于正常组(P<0.01)，符合食少纳呆的中医证型。

表2 2组小鼠每日饮食量、饮水量比较

2.4 小鼠粪便含水量、疲劳乏力比较

表3示，模型组小鼠的粪便含水量高于正常组(P<0. 01)。图2示，与正常组比较，模型组小鼠的粪便黏腻呈水样状，符合便溏的中医证型；模型组小鼠在规定的3 min 内，其运动站立时间低于正常组(P<0.01)。

表3 2组小鼠粪便含水量及疲劳乏力比较

图2 2组小鼠粪便状态图

2.5 2组小鼠脂肪体积以及分布情况

表4示，模型组小鼠腹部、皮下和内脏的脂肪总体积高于正常组(P<0.01)。图3示，2组小鼠的整体脂肪分布，模型组小鼠的皮下、腹部和内脏脂肪明显多于正常组。

注：黄色代表脂肪，白色代表其他组织；A4是由A1、A2、A3合成的正常小鼠脂肪分布立体图，A1是上切面图，A2是正切面图，A3是侧切面图；B4是由B1、B2、B3合成的模型组小鼠脂肪分布立体图，B1是上切面图，B2是正切面图， B3是侧切面图

表4 2组小鼠脂肪总体积比较

2.6 2组小鼠不同部位脂肪组织湿重及系数比较

表5示，模型组小鼠的睾周、肾周和皮下脂肪组织湿重和系数明显高于正常组小鼠(P<0.01)。

表5 2组小鼠不同部位脂肪组织湿重及系数比较

2.7 2组小鼠的葡萄糖耐量结果

图4示，2组小鼠的空腹血糖水平均在正常范围之内(7.0～11.5 mmol/L)，但模型组高于正常组(P<0.01)。正常组小鼠的血糖在30 min时升到最高，然后开始下降，2 h内基本恢复至之前浓度；而模型组小鼠的血糖水平急剧升高，30 min时升到最高，并在每个检测时间节点血糖值都高于正常组(P<0.01)，2 h内不能恢复至之前浓度，但也下降到正常范围之内。

图4 2组小鼠 GTT 实验中血糖变化比较

2.8 2组小鼠的胰岛素抵抗结果

图5示，2组小鼠的空腹血糖水平均在正常范围之内(7.0～11.5 mmol/L)，但模型组明显高于正常组(P<0.01)，正常组小鼠的血糖在60 min时降到最低，然后开始回升，2 h内基本恢复至之前浓度；而模型组小鼠的血糖水平在30 min时降到最低，然后开始回升，并在每个检测的时间节点血糖值都高于正常组(P<0.01)，2 h内不能恢复至之前浓度。

图5 2组小鼠 ITT实验中血糖变化比较

2.9 2组小鼠血糖血脂水平比较

表6示，模型组小鼠血糖水平高于正常组(P<0.01)，但其血糖水平仍在正常范围内(7.0～11.5 mmol/L)；模型组小鼠的血脂水平也高于正常组小鼠(P<0.01)。

表6 2组小鼠血糖血脂水平比较

3 讨论

依据中医理论，肥胖存在多种中医证候，然而中医治疗肥胖的证候模型仍然面临辨证与体征测试等多方面困难[6]。成功建立中医证候模型关键的步骤就是对模型进行评价，一个完善的模型评价体系是极其重要的，只有模型评价成功，才能更好地进行后续研究。课题组在参阅分析大量文献[7-9]的基础上，决定采用“饮食不节、水湿劳倦”2种传统中医复合因素，构建脾虚湿阻型单纯性肥胖小鼠模型并对其进行评价，为中医药治疗肥胖奠定基础。

本研究按照常规喂养高脂饲料构建肥胖模型的基础上加入水湿复合因素，构建脾虚湿阻型单纯性肥胖小鼠模型。实验结果显示，高脂饮食喂养10周后，模型组小鼠体质量比正常组平均增长47.06%，若以体质量增加20.0%作为肥胖标准，实验中脾虚湿阻肥胖小鼠已达到肥胖标准。使用疲劳转棒仪检测小鼠的疲劳乏力情况，结果显示脾虚湿阻肥胖小鼠在规定的3 min 内运动站立时间低于正常组2倍以上，表明模型组小鼠出现神疲乏力的情况，亦表明神疲乏力的中医证型复制成功。其次，正常组小鼠的每日进食量、饮水量相对稳定，而模型组小鼠长时间摄入高脂饮食(高脂饲料富含大量油脂、蛋白质、高糖)会导致肠胃吸收功能减弱，饮食量、饮水量明显低于正常组小鼠，并开始出现不思饮食、食少纳呆的症状，这与中医的脾虚证候类似。在造模过程中时常见到部分小鼠有软便或者稀便的出现，通过检测2组小鼠的粪便含水量发现，模型组小鼠的粪便含水量高于正常组小鼠，符合中医脾虚湿阻证型中的大便量少黏腻或溏的现象。经对小鼠行为、精神状态等进行赋分以及对体质量、饮食量、饮水量、粪便含水量和疲劳乏力等比较，结果显示造模组小鼠的体质量增加>20.0%，且症状评分≥10分的脾虚湿阻型单纯性肥胖小鼠造模成功率为81.25%，然后再进一步对模型进行评价。

肥胖常用的评价指标有体质量、体脂和血糖血脂等，其中体质量为直观指标，体脂是评价肥胖的最确切指标。使用micro-CT观察小鼠脂肪分布，计算体内脂肪总体积，结果显示模型组小鼠的脂肪体积大于正常组。图3示，模型组小鼠的脂肪分布明显多于正常组，再结合模型组小鼠的脂肪组织湿重及系数大于正常组，能更进一步显示脾虚湿阻型单纯性肥胖小鼠的体脂含量显著增高。《素问·奇病论篇》曰：“夫五味入口，藏于胃，脾为之行其精气”[10]，指出脾的功能是运化津液和水谷精气，血糖、甘油三酯及总胆固醇等作为体内水谷精微的重要组成部分，在脾虚时会出现转化输布障碍，因此血糖血脂往往作为靶向物质进行研究[11-12]。基于此，本研究通过检测2组小鼠的血糖血脂水平并对小鼠进行葡萄糖耐量与胰岛素抵抗实验，结果表明脾虚湿阻型单纯性肥胖小鼠的GLU、TC、TG、HDL、LDL和VLDL水平均高于正常组，并伴随着葡萄糖耐量异常及胰岛素抵抗的现象，这种结果表明脾虚湿阻型单纯性肥胖小鼠脾的生理功能发生了异常，其脾运化水谷精微功能发生障碍，导致无法将其吸收的水谷精微正常转输到心肺及通过肺的宣发肃降布散濡养全身。

综上所述，本研究构建脾虚湿阻型单纯性肥胖小鼠模型的操作方法简单，造模条件量化可控，造模周期相对较短，模型基本稳定，并且从中医证型角度出发，在单纯性肥胖模型复制成功的基础上筛选出符合脾虚湿阻证的肥胖小鼠并进行了评价，为中医药治疗肥胖症的临床研究提供基础实验依据，也为课题组后续探讨中药方剂治疗脾虚湿阻型单纯性肥胖小鼠的药效及作用机制奠定了基础。但在本研究中所用造模动物较单一，评价体系也尚待完善，今后可以增加胃肠功能、免疫功能、水液代谢功能等功能性指标，进一步评价脾虚湿阻型单纯性肥胖动物模型。