热处理中芡实黄酮对肌原纤维蛋白结构的影响

2021-03-31贺文杰吴彬彬王宏勋雷飞飞

食品科学 2021年6期

贺文杰，吴彬彬，胥伟,*，王宏勋，易阳，雷飞飞

（1.武汉轻工大学食品科学与工程学院，湖北武汉 430023；2.武汉轻工大学生物与制药工程学院，湖北武汉 430023；3.湖北小胡鸭食品有限责任公司，湖北荆州 434000）

肌原纤维蛋白是肉重要组成成分，其主要功能是维持肌肉伸展和收缩，用于维持肉类卤制品的感官品质。但是在高温条件下，肌纤维极易由于肌原纤维蛋白变性而碎片化，卤制品感官品质会因此劣变显著[1-3]。针对此类问题，已有研究表明，部分功能性植物中黄酮类化合物能明显抑制熟肉制品中肌原纤维蛋白氧化降解从而达到改善感官品质目的，还有部分体外实验表明，大豆中黄酮类化合物能通过抑制氨基酸侧链羰基结构的生成从而抑制牛肉制品的氧化劣变[4-6]，但是热处理条件下黄酮类物质对肌原纤维蛋白结构影响机理仍未具体阐明。

由于芡实黄酮种类丰富且含量大，以及较多的黄酮醇羟基有助于芡实黄酮与蛋白质的结合[7]，本实验将芡实黄酮作为外源植物活性物质与肌原纤维蛋白结合，并通过在90 ℃条件下对结合不同质量芡实黄酮的肌原纤维蛋白结构进行分子荧光测定、近红外光谱分析以及十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析测定，探析热处理中芡实黄酮对鸭腿肌原纤维蛋白结构的影响机理，进而解释不同芡实黄酮与肌原纤维蛋白质的质量比条件下的卤味鸭腿感官品质变化规律，以期为芡实在鸭肉卤制加工中的应用提供一定的技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

牛血清蛋白（纯度≥98%）德国BioFroxx有限公司；乙醇（食用级）、乙酸乙酯、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、甘氨酸、考马斯亮蓝、氯化镁、乙二胺四乙酸、氯化钠、氯化钾、乙二酸四乙酸二钠、苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）、β-巯基乙醇等有机试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

F-7000型荧光分光光度计、N-500近红外光谱仪日本日立公司；Evolation 300型紫外-可见分光光度计美国Thermo Fisher Scientific公司；TGL16M冷冻离心机上海安亭科学仪器厂；FA2004B分析天平、STARTER 3100 pH计奥豪斯仪器（上海）有限公司；TG16WS超速离心机湖南长沙平凡仪器仪表有限公司；HH-2恒温水浴锅金坛区白塔新宝仪器厂；UVS-1旋涡振荡器常州国华电器有限公司；FD-1冷冻干燥机、JK-2200超声波清洗机宁波新芝生物科技股份有限公司；YB-1000A型高速磨粉机浙江省永康市速峰工贸有限公司。

1.3 方法

1.3.1 鸭腿肌原纤维蛋白制备

参考Huang Feng等[8]的方法并略有改动。鸭腿用生理盐水洗去表面残血，用滤纸吸干后切碎，取2 g肉样加入20 mL缓冲液（150 mmol/L氯化钠、25 mmol/L氯化钾、3 mmol/L氯化镁、4 mmol/L乙二胺四乙酸二钠和1 mmol/L蛋白酶抑制剂（PMSF），pH 6.5），1 000 r/min匀浆30 s，然后4 ℃、5 000 r/min离心30 min，含有肌原纤维蛋白沉淀物的样液用缓冲液（50 mmol/L氯化钾、5 mmol/Lβ-巯基乙醇）冲洗3 遍，重复上述匀浆和离心过程，最后再用此溶液提取沉淀，匀浆，最终得到悬浊液即为肌原纤维蛋白提取液，蛋白浓度用双缩脲法测定，本研究中肌原纤维蛋白质量浓度为1.00 mg/mL。

1.3.2 芡实黄酮制备及测定

参考Arief等[9]的方法并略有改动。选取50 g芡实放入托盘中，置于鼓风干燥箱于65 ℃干燥8 h后，取出冷却，使用高速粉碎机粉碎3 min，连续粉碎2 次后过60 目筛得芡实粉末，放入密封袋贮藏备用。芡实粉末称取50 g（料液比1∶12（g/mL））于1 000 mL烧杯中，加入600 mL 60%的食用乙醇溶液，保鲜膜密封后开小孔，60 ℃超声提取2 h后，取出静置10 min分层，减压过滤，50 ℃旋转蒸发浓缩定容至500 mL容量瓶中，得到芡实提取液，将提取液预冻12 h，用冷冻干燥机冻干24 h，所得粉末即为芡实黄酮类物质。

由于芡实黄酮的基本结构是苯环A-取代基B-苯环C环2 个共轭体系与芦丁结构相似，本研究根据芦丁标准曲线测定芡实总黄酮含量，其中，芦丁标准曲线为y=0.102x-0.022，R2=0.969 7，本研究选取的芡实黄酮质量浓度为1.25 mg/mL。

1.3.3 卤味鸭腿感官评价

参考高雪琴等[10]的方法并略有改动。将在不同芡实黄酮与肌原纤维蛋白质量比（1∶9、1∶4、3∶7、2∶3）以及未添加芡实条件下制得的卤味鸭腿由感官评定小组（由5 位有经验的同学组成）进行感官评定，其中，未添加芡实黄酮条件下制得的卤味鸭腿记作空白组，评定标准设置为百分制，见表1。

表 1 卤味鸭腿感官评分标准Table 1 Criteria for sensory evaluation of marinated duck thigh meat

1.3.4 分子荧光测定

参考Turgut等[11]的方法并略有改动。制备芡实黄酮与肌原纤维蛋白质量比分别为1∶9、1∶4、3∶7、2∶3的混合溶液，以不添加芡实黄酮的肌原纤维蛋白溶液为空白组样液，90 ℃水浴45 min，每水浴15 min分别从最终配制好的混合溶液以及空白组样液中取2 mL进行荧光扫描。荧光扫描条件：固定激发波长296 nm，发射波长270～350 nm，激发、发射的狭缝宽度均为2.5 nm，扫描速率12 000 nm/min。

从空白组样液和芡实黄酮与肌原纤维蛋白质量比为1∶4的混合液中各取3 mL，分别测定三维荧光图谱。测定条件：激发波长200～800 nm（采样间隔2 nm），发射波长200～800 nm（采样间隔2 nm），扫描时间间隔为15 min。

1.3.5 傅里叶变换红外吸收光谱分析

参考Nguyen等[12]的方法并略有改动。制备芡实黄酮与肌原纤维蛋白质量比分别为1∶9、1∶4、3∶7、2∶3的混合溶液，90 ℃水浴45 min，每水浴15 min将混合液在500～4 500 cm-1范围内进行红外光谱测定，信号采集模式为衰减全反射模式。在相同条件下测定未添加芡实黄酮的肌原纤维蛋白溶液的红外光谱作空白组。

1.3.6 肌原纤维蛋白SDS-PAGE分析

参考Sante-Lhoutellier等[13]的方法并略有改动。分离胶和浓缩胶浓度分别为12.50%和4.00%。制备芡实黄酮与肌原纤维蛋白质量比分别为1∶9、1∶4、3∶7、2∶3的混合溶液，以未添加芡实黄酮的肌原纤维蛋白作为空白组样液，90 ℃水浴45 min，每水浴15 min后将混合液与空白组样液均按4∶1的比例与上样缓冲液进行混合。金属浴90 ℃加热5 min，取10 μL最终混合液进行凝胶电泳分析。

1.4 数据处理

实验数据经SPSS 19.0软件进行差异显著性分析，采用Peakfit对近红外光谱数据进行拟合，使用Origin 8.5软件以及Excel软件分别进行绘图和制表。

2 结果与分析

2.1 芡实黄酮与肌原纤维蛋白结合机制

由图1可知，热处理过程中，芡实黄酮与肌原纤维蛋白质量比为1∶9、1∶4、3∶7、2∶3的混合溶液的1/c（c为芡实黄酮质量浓度）（8.75、12.47、17.60、35.00（g/L）-1）与相对应的ΔFmax/ΔF（1.26、1.50、2.00、3.25）均满足Benesi-Hildebrand方程ΔFmax/ΔF=1+1/c。Chowdhury等[14]也发现高温条件下黄酮类化合物与牛血红蛋白结合机制满足Benesi-Hildebrand方程，且结合常数为2.0×103（mol/L）-1。因此，本实验选取芡实黄酮与肌原纤维蛋白质量比为1∶9、1∶4、3∶7、2∶3，并在此条件基础上进行研究。

图 1 肌纤维蛋白和芡实黄酮结合的Benesi-Hildebrand图Fig. 1 Benesi-Hildebrand plot for binding between myofibrillar proteins and gordon euryale flavonoids

2.2 热处理对芡实黄酮含量的影响

表 2 加热时间对芡实黄酮含量的影响Table 2 Influence of heating time on flavonoid content of gordon euryale seeds

为了进一步验证热处理中芡实黄酮的生物功效，将质量浓度为1.25 mg/mL芡实黄酮溶液在90 ℃条件下进行水浴加热，加热时间定为45 min，且每隔15 min测定芡实黄酮含量。由表2可知，热处理15、30、45 min的芡实黄酮质量浓度分别为1.20、1.05 mg/mL和1.04 mg/mL，这与黄惠华等[15]发现在95 ℃热处理条件下大豆异黄酮含量变化情况相似。结果表明，热处理30、45 min的芡实黄酮含量变化并不显著。这一发现验证了热处理条件下蛋白质二级结构的差异主要是由芡实黄酮初始添加量变化所致。

2.3 芡实黄酮对卤味鸭腿感官品质的影响

图 2 芡实黄酮与蛋白质质量比对鸭肉卤制品感官品质的影响Fig. 2 Effect of mass ratio of flavonoids to myofibrillar proteins on the sensory quality of marinated duck meat

由图2可知，卤味鸭腿感官评分随芡实黄酮与肌原纤维蛋白质量比增大呈先增后减的趋势，相较于空白组的卤味鸭腿，在质量比为1∶9条件下的卤味鸭腿感官评分最高（85），这与江云涛[16]发现芡实添加量对饼干感官品质的影响结果相似。结果表明，卤味鸭腿感官品质与芡实黄酮添加量不呈正相关，因此，本实验将通过研究热处理中芡实黄酮对肌原纤维蛋白结构的影响进而对这一变化规律进行解释。

2.4 荧光光谱分析芡实黄酮对肌原纤维蛋白二级结构的影响

图 3 不同加热时间下肌原纤维蛋白和芡实黄酮-蛋白混合物的荧光曲线Fig. 3 Fluorescence spectra of myofibrillar protein-flavonoid mixtures at different heating times

由于肌原纤维蛋白中主要荧光物质为色氨酸和酪氨酸残基，选取波长296 nm作为固定激发波长，在此波长下可认为肌原纤维蛋白中内源荧光来自色氨酸残基[17]。如图3所示，热处理15、30、45 min的空白组肌原纤维蛋白在发射波长296 nm的荧光峰强度依次减少，分别为291、135、114；热处理30、45 min的空白组肌原纤维蛋白在发射波长315 nm处的荧光强度分别由18增至28、43，其中，发射波长315 nm处的荧光物质为氨基酸氧化产物与其他物质反应生成物质。当芡实黄酮与肌原纤维蛋白质量比为1∶4且混合液热处理30、45 min时，发射波长为315 nm荧光峰的荧光强度分别降至4、5，且远低于空白组（28、43），同时发射波长为296 nm处荧光峰荧光强度分别降至41、5，此结果与朱颖等[18]利用荧光光谱分析得到热处理中花青素对大豆蛋白氨酸残基结构变化情况相似。

图 4 肌原纤维蛋白（A）与肌原纤维蛋白结合黄酮（B）的三维荧光图谱Fig. 4 Three-dimensional fluorescence spectra of myofibrilar proteins alone (A) and in combination with gordon euryale flavonoids (B)

为进一步对比热处理条件下芡实黄酮与肌原纤维蛋白质量比为1∶4的混合液和空白组样液蛋白质二级结构差异，本研究对两者进行三维荧光光谱分析，其中，根据色氨酸以及各类氨基酸荧光峰所对应波长大小，选取发射波长以及激发波长范围为200～800 nm[19-21]。由图4可知，当芡实黄酮与肌原纤维蛋白质量比为1∶4且混合液热处理45 min时，蛋白质三维荧光区域λEx300～500 nm，λEx500～800 nm以及λEm550～800 nm，λEm250～450 nm区域面积缩减至空白组的1/3且更加分散，同时散射峰a、c的荧光强度降低，此结果与Lee等[22]利用三维荧光光谱分析结合泡菜提取物后肉中蛋白质二级结构变化情况相似。

综上所述，当两者质量比为1∶4时，芡实黄酮能通过分解肌原纤维蛋白表面水层进而与蛋白结合，由两者结合所形成的不发光基态复合物能使蛋白质多肽链骨架以及蛋白质结构发生变化，进而一定程度上抑制色氨酸降解产物的进一步氧化，但与此同时，肌原纤维蛋白二级结构也开始发生明显裂解，因此，仅管卤味鸭腿中由氨基酸氧化造成的异味有一定程度减少但整体感官品质仍低于最佳状态。同时，由于目前国内卤制品加工仍存在落后产能过剩以及标准化程度低等问题，大多食品企业开始采用外源植物提取液代替固体外源植物添加物进行卤制[23]。根据胡爱军[24]和姜国庆[25]等发现的鸭肉中总蛋白含量占比15.50%，总蛋白中肌原纤维蛋白含量占比50%～55%，其次，本实验中芡实提取液冷冻干燥前后质量比为100∶1（g/g）以及芡实提取液制备中芡实与食用乙醇料液比为1∶12（g/mL），可以得知在芡实黄酮与肌原纤维蛋白质量比为1∶4条件下，卤制1 000 g鸭腿大致需要2 000 mL芡实提取液，其中，芡实提取液制备需使用167 g芡实，因此，此条件虽然可以使卤味鸭腿感官品质在空白组基础上有一定程度提升，但是也明显增加了工业成本。

2.5 傅里叶变换近红外光谱分析

图 5 不同加热时间和芡实黄酮添加量的肌原纤维蛋白近红外峰拟合曲线Fig. 5 Near infrared peak fitting curves of myofibrillar proteins with different amounts of added gordon euryale flavonoids at different heating times

表 3 非结合型和结合型芡实黄酮肌纤维蛋白近红外光谱参数Table 3 Secondary structure composition of myofibrillar proteins with different amounts of added gordon euryale flavonoids at different heating times

选取红外光谱的酰胺I带分析肌原纤维蛋白的二级结构组成，采用Peakfit软件对蛋白质酰胺I带进行解析，首先对所得红外光谱的酰胺I带进行傅里叶去卷积处理，控制半峰宽为5 cm-1，增强因子为1.0。结合原始图谱（图5）和去卷积谱得到的子峰峰位，进行相应二级结构构象指认。其中，各峰位的归属指认依据：β-折叠结构，1 637、1 615、1 695 cm-1；β-折叠或β-转角结构，1 684 cm-1；β-转角结构，1 670 cm-1；α-螺旋结构，1 640 cm-1；无规卷曲结构，1 649 cm-1。

如表3所示，肌原纤维蛋白主要结构为β-折叠，混合液热处理45 min后，空白组中α-螺旋占比由16.85%降至8.56%、β-折叠占比由44.95%增至51.03%、β-转角占比由9.79%增至11.76%、无规卷曲结构占比由28.41%增至28.65%。当芡实黄酮与肌原纤维蛋白质量比为1∶9且混合液热处理30 min时，β-转角占比降至最低（12.24%），且远低于空白组（25.72%），此结果与Serson[26]和Carbas[27]等利用近红外光谱分析所得热处理中大豆蛋白、丹参蛋白二级结构变化情况相似。结果表明，热处理使蛋白质中α-螺旋结构转变为β-折叠进而转变为β-转角和无规卷曲结构，芡实黄酮能通过降低蛋白质无规卷曲结构占比以及β-转角的占比进而维持蛋白质二级结构整体稳定，同时，相较于其他条件下制得的卤味鸭腿，当混合液中芡实黄酮与肌原纤维蛋白的质量比为1∶9时，蛋白与呈味物质的结合位点由于β-转角和无规卷曲结构占比减少以及蛋白质聚集程度降低而大量暴露，因此，此时卤味鸭腿整体香味较好且整体感官品质最佳。

2.6 肌原纤维蛋白SDS-PAGE结果

图 6 不同芡实黄酮添加量和加热时间的肌原纤维蛋白电泳图Fig. 6 SDS electrophoretograms of myofibrillar proteins with different amounts of added gordon euryale flavonoids at different heating times

由图6可知，空白组中肌原纤维蛋白随着热处理时间延长，肌球蛋白重链、α-辅肌动蛋白、肌钙蛋白T+以及肌球蛋白轻链I都发生严重降解。相较于空白组，当芡实黄酮与肌原纤维蛋白质量比为1∶9且混合液热处理30 min时，这几类蛋白组分的条带最为清晰，此时芡实黄酮的生物功效最为显著，然而当混合液中芡实黄酮与肌原纤维蛋白质量比为1∶4、3∶7、2∶3时，热处理中这几类蛋白组分降解程度均明显增大，且混合液热处理45 min后，仅存一条较浅肌球蛋白轻链II条带，此结果与Shin[28]、Carlsen[29]和Bandyopadhyay[30]等利用SDS-PAGE分析加工过程中牛背肌肌原纤维蛋白、猪肉中肌原纤维蛋白以及天然植物蛋白降解情况相似。结果表明，热处理使肌原纤维蛋白内部蛋白组分严重降解，芡实黄酮能通过维持热处理中肌原纤维蛋白内部蛋白组分结构完整进而稳定肌原纤维蛋白结构，同时相较于其他条件下卤味鸭腿，当混合液中芡实黄酮与肌原纤维蛋白的质量比为1∶9时，α-辅肌动蛋白和肌钙蛋白T+的降解程度最小，由于α-辅肌动蛋白和肌钙蛋白T+的降解程度是肌纤维Z线、肌纤维I带重要组成部分，此条件下卤味鸭腿的滋味和组织状态较好且整体感官品质最佳。