LncRNA CASC7与miR-27b-3p在肺结核外周血单核细胞中的表达及意义

肖欢容 王少锋 蔡志钢

肺结核是我国临床常见的一种慢性传染病，其主要病因为结核分枝杆菌，且已严重威胁人类身体健康，因而寻找肺结核相关基因及快速诊断对提高肺结核治疗效果具有重要意义[1]。单核细胞在机体免疫及免疫应答过程中发挥重要作用，并可作为感染防御中的第一道防线，其可通过清除结核分枝杆菌从而发挥作用[2]。长链非编码RNA在肺结核患者中异常表达并可能作为诊断肺结核的重要辅助标志物[3-4]。长链非编码RNA CASC7(LncRNA CASC7)在缺血再灌注损伤大鼠中表达水平降低，上调其表达可抑制神经元细胞凋亡[5]。生物信息学分析显示微小RNA-27b-3p(miR-27b-3p)可能是CASC7的靶基因，研究表明miR-27b通过下调TET2表达而促进ox-LDL诱导的内皮细胞炎症反应及细胞凋亡[6]。但CASC7是否通过调控miR-27b-3p的表达从而参与肺结核发生过程尚未阐明。因此，本研究主要探讨CASC7与miR-27b-3p在肺结核外周血单核细胞中的表达及其意义。

资料与方法

一、一般资料

选取2018年3月至2019年10月本院收治的肺结核患者120例为研究组，所有患者均符合中华医学会《临床诊疗指南:呼吸病学分册》相关诊断标准[7]。经痰涂片检查显示均为阳性，且肺部无其他细菌、真菌及病毒感染，患者均无合并心、肝、肾等脏器疾病，其中男70例，女50例，年龄48～75岁，平均年龄(59.63±8.59)岁。根据活动性肺结核诊断标准将肺结核患者分为非活动性肺结核组60例、活动性肺结核组60例[8]，其中活动性肺结核患者治疗方案为2HREZ/4HR。同时选取同期健康体检者60例为对照组，其中男30例，女30例，年龄50～70岁，平均年龄(60.21±9.25)岁。排除标准：合并自身免疫性疾病；合并肿瘤患者。各组研究对象年龄(t=0.416，P=0.678)、性别(=1.125，P=0.289)比较差异无统计学意义，具有可比性。本研究经本院伦理委员会批准，所有患者知情且签署同意书。

二、主要试剂及仪器

Trizol试剂、Lipofectamine2000购自美国Invotrogen公司；反转录试剂盒购自美国Thermo Fisher公司；荧光定量检测试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；miR-27b-3p寡核苷酸模拟物(miR-27b-3p mimics)及阴性对照mimic NC序列(miR-NC)、CASC7小分子干扰RNA(si-CASC7)、乱序无意义阴性序列(si-NC)购自上海吉玛制药技术有限公司；pcDNA3.1购自上海索宝生物科技有限公司；荧光素酶报告基因载体及其活性检测试剂盒购自美国Promega公司；结核菌强毒株H37Rv与弱毒株H37Ra购自美国ATCC公司；CD14+免疫磁珠购自德国Miltenyi公司；7500型荧光定量PCR仪购自美国ABI公司；MACS自动磁珠分选仪购自上海秉新生物科技有限公司。

三、方法

1 分离外周血单核细胞

分别抽取所有研究对象外周血5 mL，采用肝素锂抗凝，应用密度梯度离心法分离外周血单核细胞，细胞计数(1×107个/mL)，加入CD14+免疫磁珠(5 μL)，置于4 ℃冰箱内孵育20 min，应用MACS自动磁珠分选仪分离CD14+单核细胞。

2 实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测CASC7与miR-27b-3p的表达水平

采用Trizol法提取单核细胞总RNA，反转录合成cDNA，按照试剂盒说明书进行qRT-PCR反应，用2-ΔΔCt法计算CASC7与miR-27b-3p相对表达量。

3 体外验证实验[9]

H37Rv、H37Ra分别感染单核细胞，置于培养箱内孵育90 min，取出细胞，采用Trizol法提取细胞总RNA，qRT-PCR法检测CASC7与miR-27b-3p相对表达量。

4 双荧光素酶报告基因检测CASC7与miR-27b-3p的靶向关系

利用基因突变技术将结合位点进行突变，将结合位点与突变位点载入荧光素酶报告基因载体分别构建野生型载体WT-CASC7与突变型载体MUT-CASC7，分别将miR-NC、miR-27b-3p mimcs与WT-CASC7、MUT-CASC7共转染至人单核细胞，置于培养箱培养24 h，检测各组荧光素酶活性。

四、统计学处理

结 果

一、体外实验验证CASC7与miR-27b-3p的表达量

与感染前比较，H37Rv、H37Ra感染后单核细胞中CASC7的表达水平显著降低(P<0.05)，miR-27b-3p的表达水平显著升高(P<0.05)(见表1)。

表1 体外实验验证CASC7与miR-27b-3p的表达量

二、CASC7靶向调控miR-27b-3p

LncBase v.2预测显示CASC7与miR-27b-3p存在靶向结合位点(见图1)。双荧光素酶报告实验结果显示miR-27b-3p过表达可明显抑制野生型载体WT-CASC7的荧光素酶活性(P<0.05)(见表2)。CASC7负向调控miR-27b-3p的表达(P<0.05)(见表3)。

图1 CASC7的序列中含有与miR-27b-3p互补的核苷酸序列

表2 双荧光素酶报告实验

表3 CASC7靶向调控miR-27b-3p的表达

三、肺结核患者外周血单核细胞中CASC7与miR-27b-3p的表达量

与对照组比较，研究组患者外周血单核细胞中CASC7的表达水平显著降低(P<0.05)，miR-27b-3p的表达水平显著升高(P<0.05)(见表4)。

表4 肺结核患者外周血单核细胞中CASC7与miR-27b-3p的表达量

四、活动性肺结核与非活动性肺结核患者外周血单核细胞中CASC7与miR-27b-3p的表达量

与非活动性肺结核组比较，活动性肺结核组患者外周血单核细胞中CASC7的表达水平显著降低(P<0.05)，miR-27b-3p的表达水平显著升高(P<0.05)(见表5)。

表5 活动性肺结核与非活动性肺结核患者外周血单核细胞中CASC7与miR-27b-3p的表达量

五、ROC分析CASC7与miR-27b-3p对肺结核的诊断价值

ROC分析CASC7与miR-27b-3p对肺结核的诊断价值，结果显示CASC7诊断时敏感度为57.50%，特异度为91.67%，AUC面积为0.781，95%CI：0.713-0.839，截断值为0.85；miR-27b-3p诊断时敏感度为57.50%，特异度为81.67%，AUC面积为0.665，95%CI：0.591～0.733，截断值为1.08；联合检测时敏感度为96.67%，特异度为60.00%，AUC面积为0.802，95%CI：0.736～0.858，截断值为0.51(见图2)。

图2 ROC分析CASC7与miR-27b-3p对肺结核的诊断价值

讨 论

CASC7可通过调节miR-21的表达而抑制心肌缺血再灌注大鼠的心肌细胞凋亡[10]。CASC7通过靶向miR-21而抑制PI3K / AKT信号通路从而增强严重哮喘患者糖皮质激素的敏感性[11]。CASC7还可在神经母细胞瘤等肿瘤中异常表达，并可参与肿瘤发生及发展过程[12]。本研究结果显示肺结核患者外周血单核细胞中CASC7的表达水平降低，提示CASC7在肺结核发生过程中可能发挥重要调控作用。进一步研究显示活动性肺结核组患者外周血单核细胞中CASC7的表达水平低于非活动性肺结核组，提示CASC7水平高低可能用于判断肺结核疾病严重程度或疾病进展。同时本研究采用ROC分析CASC7对肺结核的诊断价值，结果显示敏感度与特异度较高，提示CASC7对肺结核具有一定诊断价值。但单项检测具有一定假阳性或假阴性，而两项或多项联合检测可提高诊断效率。

本研究结果显示肺结核患者外周血单核细胞中miR-27b-3p的表达水平升高，进一步分析显示活动性肺结核患者外周血单核细胞中miR-27b-3p的表达水平高于非活动性肺结核患者。miR-27b-3p在急性缺血性卒中患者中表达水平升高，并可能作为诊断急性缺血性卒中的生物标志物[13]。miR-27b-3p过表达可减轻心房纤维化[14]。miR-27b-3p通过靶向HIPK2而抑制类风湿关节炎中的软骨细胞凋亡[15]。表明miR-27b-3p在炎症性疾病中高表达，并可能发挥重要调控作用。本研究结果提示miR-27b-3p在肺结核发生及发展过程中可能发挥重要调控作用。进一步分析显示CASC7与miR-27b-3p联合检测可明显提高敏感度。目前关于CASC7与miR-27b-3p在肺结核发生及发展过程中作用机制尚未见相关报道，本研究通过体外实验证实H37Rv、H37Ra菌株可明显抑制CASC7的表达及促进miR-27b-3p的表达，分析原因可能是单核细胞在结核菌感染过程中发挥重要作用，而肺结核患者单核细胞中CASC7、miR-27b-3p分子的差异表达，可准确反映单核细胞感染结核菌后机体出现免疫应答反应，因而CASC7、miR-27b-3p可能作为诊断肺结核的潜在生物标记，并可能作为肺结核靶向治疗的潜在靶点。同时本研究采用双荧光素酶报告实验与qRT-PCR实验证实CASC7可靶向结合miR-27b-3p，并可负向调控miR-27b-3p的表达。提示CASC7可能通过负向调控miR-27b-3p的表达从而参与肺结核发生及发展过程。(过多的描述了本文的研究结果，而没有与以往研究进行机理上或者不同疾病中发挥作用的对比)回复：CASC7与miR-27b-3p在肺结核发生及发展过程中作用机制撒尚未见相关报道。

综上所述，肺结核外周血单核细胞中CASC7的表达水平降低，miR-27b-3p的表达水平升高，二者联合检测可提高肺结核诊断效率，CASC7可能作为肺结核治疗的潜在靶点，但关于CASC7在肺结核患者体内表达降低是否与细胞凋亡有关，及其具体作用机制仍需深入探究。