GRP78、Derlin-1在肺纤维化大鼠模型中的表达研究

刘贲 李旭梅 戴曦 袁竞 詹倩 王荣丽

特发性肺纤维化( IPF)是一种常见的慢性进行性呼吸系统疾病，以肺泡上皮细胞损伤、成纤维细胞/肌成纤维细胞聚集和细胞外基质沉积为特征[1]。病因及病理生理过程复杂，尚无有效的临床治疗手段。既往研究表明氧化应激和过度炎症反应在肺纤维化中起到重要作用[2]，而内质网应激(ERS)与氧化应激反应、细胞凋亡有着紧密关系,并与炎症相互关联[3-4]，过度的ERS还会增加肺纤维化的易感性[5]，ERS与肺纤维化似乎有密切联系。在ERS级联反应中，GRP78的表达上调被认为是ERS和UPR的激活标志[6]。持续的ERS刺激Derlin-1的表达，参与ERAD缓解ERS，避免细胞凋亡[7-8]。本研究通过分析Derlin-1和GRP78在肺纤维化动物模型中的的表达，探讨ERS在肺纤维化过程中的作用，寻找新的诊疗靶点。

资料和方法

一、实验动物、药品、试剂

清洁健康雄性SD大鼠50只，8～10周龄，体质量(210±10)g，购于西南医科大学动物实验中心，常规饲养1周后进行造模。质量浓度20%的百草枯(先正达南通作物保护有限公司)；Masson三色染色试剂盒(北京雷根生物科技有限公司)；DERLIN-1抗体(北京布尔森股份有限公司)；GRP78抗体(美国BioWorld公司)；SP试剂盒(迈新公司)；ELISA试剂盒(R&D公司)。

二、模型制备

将50只大鼠随机分为染毒组和对照组，染毒组根据染毒后不同时间随机分为Day1、Day7、Day14、Day21共4个亚组，每组均为10只。染毒组通过腹腔注射15 mg/kg剂量百草枯诱导小鼠肺纤维化；对照组腹腔注射等量生理盐水。通过观察大鼠食欲不振、反应迟缓、斜视、垂发、身体卷曲、缺乏运动和呼吸困难等现象判断造模是否成功，剔除不符合判定标准或死亡模型后，每组最终有6只大鼠纳入研究结果分析。所有染毒组大鼠分别于染毒后第1、7、14、21天处死；对照组在第1天处死，随机抽取6只作为对照。

三、计算肺系数

肺系数常作为监测实验动物肺水肿的指标。大鼠处死后称重，开胸分离双肺，观察肺组织病理变化；用滤纸吸干双肺表面的液体后称取湿重，按公式(肺系数=肺湿重(mg)/大鼠体重(g)×100%)计算肺系数。

四、肺组织HE染色及Masson染色

分离左肺下叶制作石蜡切片，行常规HE染色和Masson染色，光镜下观察肺组织病理学改变，参照Szapiel标准[9]评定肺组织炎症程度和纤维化程度(表1)。

表1 Szapiel等的肺组织病理评分标准

五、免疫组化检测Derlin-1和GRP78的表达

在200倍显微镜下仔细观察制备好的肺组织切片，每张切片随机选取5个视野，采用Img-Pro6.0图像分析系统测量阳性细胞的平均光密度(OD)值，分析肺组织切片标本的Derlin-1、GRP78阳性表达强度。

六、Elisa检测肺组织中Derlin-1的表达水平

分别称取200mg肺组织/只，用冰冻的生理盐水漂洗干净后分别加入2 mL冰冻的生理盐水，剪碎后制备组织匀浆，低温离心机中以3 000 r/min、4℃的条件下离心15分钟，取上清液，-80℃冻存备用。按照Elisa试剂盒操作说明书检测肺组织匀浆样本中Derlin-1的表达水平。

七、统计分析

用SPSS 17.0软件进行分析，计量数据以均数±标准差表示，各多组间的比较采用单因素方差分析，以SNK法进行多重比较。P<0.05为差异具有统计学意义。

结 果

一、大鼠染毒后的一般情况

对照组大鼠表现正常。而染毒组大鼠在染毒30分钟后分别出现不同程度的中毒现象，可观察到大鼠出现明显反应迟钝、食欲不振、毛发蓬松、呼吸急促、鼠尾发绀、喜蜷缩少动、易捕捉等现象。1天后，染毒组上述症状加重，部分大鼠口鼻紫绀甚至死亡。第7天起，染毒组存活下的大鼠出现精神好转、进食逐渐增多、体重逐渐上升表现，至第21天大鼠上述急性期症状基本消失，但较对照组大鼠生长欠佳。

二、肺大体形态观察及肺系数评定

对照组大鼠的肺组织光滑红润，质地柔软，富有弹性。Day1组肺组织可见轻度水胀、充血；Day7组较Day1组出现肺淤血，水肿加重；Day14组肺组织水肿淤血明显，肺局灶性实变，弹性下降；Day21组大鼠肺组织实变面积较大，体积明显缩小，颜色苍白，质地坚硬。

肺系数分析结果显示：单因素方差分析组间比较F值为98.416，P<0.001。两两比较时，Day1、Day7、Day14组大鼠的肺系数均高于对照组(P<0.05)，Day7组最高，Day14组较Day7组开始出现下降，组间比较均为P<0.05；而Day21组肺系数与对照组比较，差异无统计学意义(P=0.561，P>0.05)(见表2)。

表2 大鼠肺系数评定

三、肺组织HE染色病理表现及炎症评分

对照组大鼠肺泡结构清晰完整，无充血、水肿、炎性渗出；Day1组可见毛细血管扩张充血，伴少量炎症细胞浸润；Day7组部分支气管上皮细胞脱落，血管明显充血，肺泡炎症反应明显，腔内可见水肿液，间隔增厚；Day14组部分肺泡塌陷，结构紊乱，肺间质增厚，炎性细胞浸润减少，伴有较多成纤维细胞增生；Day21组肺组织炎症反应消失，结构明显破坏，肺泡间隔增宽、管腔缩小，大量纤维细胞增生。结果见表3，图1。单因素方差分析组间比较F值为147.469，P<0.001。

图1 大鼠肺组织HE染色(×100)

表3 肺泡炎症程度评分

四、肺组织Masson染色及肺纤维化评分

正常对照组肺组织结构清晰，周围仅有少量蓝染的生理性胶原纤维；Day1组肺组织可见蓝染的胶原纤维增多；Day7组部分肺组织被纤维细胞和成纤维细胞所替代，可见少许蓝染胶原沉积；Day14组胶原纤维增生，蓝染面积增大，肺间质呈纤维性增生；Day21组蓝染胶原沉积明显。评分显示染毒组肺纤维化评分均高于对照组，且随染毒时间延长评分越来越高，除Day1组，Day7、Day14和Day21组与对照组相比较差异均有统计学意义(P<0.05)，其中Day14组较Day7组评分明显升高(P<0.05)，而Day14组与Day21组比较差异无统计学意义(P>0.05)，单因素方差分析组间比较F值为206.982，P<0.001(见表4、图2)。

图2 大鼠肺组织Masson染色(×100)

表4 肺纤维化程度评分

五、免疫组化观察肺组织中Derlin-1、GRP78表达水平

显微镜下肺组织细胞核呈蓝色，Derlin-1阳性表达为棕黄色颗粒。免疫组化结果显示Derlin-1、GRP78表达部位相似，均主要表达于支气管上皮细胞、肺泡上皮细胞和血管内皮细胞的胞浆中。分析Derlin-1阳性表达水平发现，染毒组的Derlin-1表达均高于对照组(P<0.05)，于Day14组表达最高，与Day7组相比较(P<0.05)；Day21组有所下降，Day1组、Day7与Day21组两两比较，差异无统计学意义(P>0.05)，单因素方差分析组间比较F值为12.692，P<0.001(见表5、图3)。分析GRP78阳性表达水平发现，染毒组的GRP78表达均高于正常对照组(P<0.05)，于Day7组表达最高，Day14、Day21组较Day7组有所下降，各组两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)，单因素方差分析组间比较F值为303.541，P<0.001(见表6、图4)。

图3 大鼠肺组织免疫组化检测Derlin-1表达(×100)

图4 大鼠肺组织免疫组化检测GRP78表达(×100)

表5 大鼠Derlin-1表达水平

表6 大鼠GRP78表达水平

六、肺组织匀浆中Derlin-1的表达

通过ELisa法检测肺组织匀浆中Derlin-1的表达水平，结果显示Derlin-1随染毒时间缓慢升高，于Day14组表达最高，Day21组较Day14组表达降低，各组间两两相互比较差异均有统计学意义(P<0.05)，单因素方差分析组间比较F值为552.184，P<0.001。该结果与免疫组化观察结果趋势一致(见表7)。

表7 大鼠肺组织匀浆中Derlin-1表达水平

讨 论

肺纤维化是以成纤维细胞增殖及大量细胞外基质聚集并伴炎症损伤、组织结构破坏为特征的一大类肺疾病的终末期改变。该疾病的发生发展过程尚不完全明确，现认为与细菌、病毒感染，药物，自身免疫性疾病，烟草及粉尘接触，以及环境污染有一定的关系[10]。近年来发病人数逐年增加，临床治疗手段以糖皮质激素、免疫抑制剂及抗纤维化药物为主，但疗效不尽人意，造成了沉重的公共卫生经济负担，急需新的治疗靶点。真核细胞为应对内质网腔内未折叠或错误折叠的蛋白质及其异常聚集，启动内质网应激级联反应，折叠蛋白反应(UPR)、整合应激反应(ISR)和内质网相关降解(ERAD)被激活，其目的是阻止蛋白质翻译，改善蛋白质折叠，维持细胞内稳态，避免因未折叠或错误折叠蛋白的积累而导致细胞死亡[11-12]。既往多项研究表明通过抑制ERS能够缓解炎症，抑制细胞凋亡，减少组织损伤，在哮喘、ARDS、COPD等呼吸系统疾病发生发展中起到重要作用。近年来许多研究发现ERS与肺纤维化也有密切关系[13-14]，本文通过百草枯染毒复制肺纤维化动物模型，观察GRP78和Derlin-1的表达以探寻内质网应激与肺纤维化的关系。GRP78是内质网腔内的分子伴侣蛋白，当发生ERS时，其与内质网的3种跨膜蛋白解离并主动与未折叠或错误折叠蛋白结合，GRP78的上调标志着ER stress的启动[15]。实验中我们用免疫组化的方法检测肺组织中GRP78表达，结果显示，GRP78于染毒1天后表达明显升高，在染毒第7天达到最高后开始下降，第21天较第14天明显下降(P<0.001)，仍高于对照组，各组数据相比较，差异均具有统计学意义。因此我们认为染毒大鼠肺组织内确实发生了ERS。早期机体启动ER stress，GRP78于染毒早期升高，促进错误折叠及未折叠蛋白的折叠、转运、降解，减少细胞损伤；后面GRP78的表达开始降低，表明内质网损伤已不可逆，无法恢复正常功能时则启动凋亡信号通路，清除受损肺泡上皮细胞，成纤维细胞增殖，胶原沉积，最终导致肺纤维的形成。免疫组化结果显示Derlin-1主要表达于肺泡上皮细胞和血管内皮细胞胞浆中，免疫组化、ELISA两种方法检测Derlin-1的表达均显示，染毒组中Derlin-1的表达随时间先升高后降低，Day14组表达最高，Day21组有所下降但仍高于Day1、Day7组，各组数据差异具有统计学意义。综上表明百草枯中毒后诱导了肺泡上皮细胞发生ERS。且为应对持续存在或过强的ERS诱导细胞凋亡，作为一种保护性的内质网应激蛋白Derlin-1在染毒早期升高，阻止过强的ER相关性凋亡的出现。随时间延长，Derlin-1的表达有所下降，可能系已出现不可逆转的肺损伤，ERS启动的凋亡作用超过了其保护性作用，ERS持续性发展，进一步促进了肺纤维化的形成，并最终发展成为不可逆性的肺间质纤维化。实验通过对各组病理组织进行肺泡炎和肺纤维化的程度的评分，对肺系数进行测定，结果对照显示早期示以急性肺泡炎反应为主，后期则出现肺间质的纤维化，近年来也有越来越多的研究表明炎症反应与内质网应激有着紧密联系[16]，而持续的炎症反应和异常修复，也是肺纤维化的诱因[17]，故内质网应激和肺纤维化之间也有某种联系。

目前认为百草枯在体内诱导急性氧化还原反应，不但导致直接损伤，还使得活性氧物质(ROS)过度激活，调节肺内不同的促炎介质促进炎症反应，诱导前纤维化因子的产生，形成肺损伤，最终导致肺纤维化[18]。我们通过本研究，在百草枯染毒大鼠肺组织细胞中观察到GRP78和Derlin-1的表达水平在早期上升，证实了内质网应激参与了肺纤维化的病理过程，其规律性变化亦验证了内质网应激与肺纤维化的形成关系密切。该研究结果为进一步揭示肺纤维化的分子机制，以为寻求新的诊治靶点提供了可靠的基础研究依据。